早期介入麦粒灸对转基因阿尔茨海默病小鼠脑内APP蛋白表达的研究*

高灵爱,包烨华,张永生,楚佳梅

(1.余杭区第五人民医院，浙江 杭州 311100；2.杭州市中医院，浙江 杭州 310007；3.浙江中医药大学，浙江 杭州 310007)

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD) 是威胁人类健康的主要疾病之一，并随着人类寿命的延长，发病率呈明显增高趋势，患者通常在发病后数年内死亡。现代研究证明，阿尔茨海默病的病理始发因素和中心环节是β淀粉样蛋白(β-amyloid peptide，Aβ)的沉积[1]。β-淀粉样蛋白前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)是由Aβ经过β、γ分泌酶依次裂解产生[2-3]。APP表达增加被认为是AD的风险因素之一。现代研究发现，β-APP与AD的发生有密切关系[4]，有研究报道[5]APP可能在抑制AD的发生中发挥重要作用，其在通过LRPI调节脑中apoE代谢及建立APP与apoE之间的生物联系中APP的γ分泌酶切割发挥着核心作用。APP能够通过促进神经生长因子产生从而促进轴突生长。APP可以促进突出形成、生长和牵引；APP具有诱导和维持长时程记忆的作用[6]。Stokin等[7]指出过量表达的APP会导致神经元轴突功能损害，且这种损害与Aβ的产生无关。因此，本实验以中医“治未病”思想为指导，拟“补肾养心”为治则，利用麦粒灸未病先防、防病传变及无毒副作用的特点，早期介入麦粒灸治疗APP/PS1转基因小鼠，观察淀粉样前体蛋白表达，从而抑制β淀粉样蛋白的沉积，进一步影响老年斑的形成，最终预防老年痴呆的发生。

1　材料与方法

1.1　动物与分组

由上海生命科学院景乃禾研究员惠赠的1.5月龄的B6SJL-Tg(APPSwFlLon, PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/J品系、双转基因AD小鼠杂合体种鼠4只，由中科院上海实验动物中心及上海斯莱克实验动物有限公司提供[SCXK(沪)2007-0005]配种鼠；以上所用鼠均在浙江中医药大学SPF级转基因实验动物中心饲养保种并繁衍产生后代，用PCR实验方法在子鼠出生后3～4周龄时进行转基因鉴定。

依据符合科技部相关善待实验动物的伦理学规定处置实验过程中动物。按随机数字表将APP/PS1双转基因阳性雌性小鼠17只随机分为两组，一组9只为模型组，另一组8只为治疗组，9只同龄同背景的C57BL/6J阴性雌性小鼠为正常对照组。

1.2　主要试剂及仪器

一抗：兔抗APP(批号bs-0112R，由北京博奥森生物技术有限公司提供)；二抗：鼠抗兔IgG(批号SP-9001，由北京博奥森生物技术有限公司提供)；浓缩型DAB试剂盒(ZLI-9032,批号60882801，由北京中杉金桥生物技术有限公司提供)；PTC-200 PCR 扩增仪(由Biorad 公司提供)；艾绒：艾灸王(直径18 mm×200 mm，中国汉医艾绒)。

1.3　动物模型基因鉴定方法

用PCR实验方法鉴定APP/PS1双转基因小鼠实验过程，取3周龄子代小鼠鼠尾约0.5 cm入离心管内→加裂解液→56℃转动过夜→离心后异丙醇混匀→离心沉淀DNA→琼脂糖凝胶电泳检DNA片段→读取跑胶结果：Tg(APP):转基因377 bp和野生型324 bp;Tg(PS1):转基因608 bp和野生型324 bp。结果见图1。

图1　电泳结果　　注：M为Marker，其中，1、2、5、6、7、9、11、13、14、17、19、21、22、24、26、28、29为APP/PS1双转基因阳性小鼠

检测出29只雌性子代小鼠取PCR产物长度为Tg(APP) 377 bp和Tg(PS1)608 bp的17只双转基因阳性雌性小鼠为本实验研究对象，随机分为两组分别为9只模型组和8只治疗组。

1.4　治疗方法

本实验开始之前剔除AD小鼠穴位区域的毛发，参照中国针灸学会实验针灸分会制定《动物针灸穴位图谱》、比较解剖学的方法为本实验小鼠取“心俞”“肾俞”穴。采取人工固定小鼠的方法，分别给实验组小鼠施行操作，具体方法如下：模型组予抓取固定等刺激和正常组不做任何处理；治疗组予提前备好麦粒大小圆锥形艾炷(直径5 mm×高8 mm)放置“心俞”“肾俞”穴，待艾炷燃烧至3/5时镊子即去除，每次每穴灸一壮(时间约25 s～30 s)，1次/日，10次作为1个疗程，疗程之间休息2天，施行9个疗程后结束治疗。实验中意外烫伤处理可涂湿润烧伤膏少许予穴位处；在治疗过程中，可能由于转基因模型小鼠较正常鼠身体素质偏弱，治疗组小鼠死亡1只，模型组死亡2只，予以剔除。

1.5　观察指标及检测方法

1.5.1组织取材3组实验小鼠治疗结束→腹腔麻醉暴露胸腔→予生理盐水和多聚甲醛灌注心脏→开颅取脑多聚甲醛固定→常规石蜡包埋→视交叉前后冠状切片→读片。

1.5.2尼氏体染色取相邻部位的脑片→石蜡切片脱腊→蒸馏水洗→放甲苯胺蓝水溶液→烤箱孵育→蒸馏水洗→乙醇快速脱水→二甲苯透明→中性树胶封片→光学显微镜观察拍照。

1.5.3APP免疫组化取切片→置烤箱烘烤→常规脱蜡至水→微波修复抗原→入枸椽酸盐缓冲液中置在微波炉中加热→洗涤阻断过氧化物酶→PBS洗→滴加稀释的一抗→孵育(APP为1∶150)PBS洗→滴加二抗→孵育PBS洗→DAB显色→复染透明后封片→显微镜观察→以切片海马区和额叶皮层各取6个视野(×400)→采用计算机分析(图像分析软件Image Pro-plus5.0)测量阳性面积(area)、总光密度值(Integrated optical density)→数据汇总。

1.6　统计学处理方法

2　结果

2.1　APP/PS1双重转基因小鼠脑内额叶皮层及海马区尼氏体染色观察早期神经元损伤的情况

尼氏体染色后，光镜下可见正常组小鼠额叶皮层及海马区神经元胞核染成蓝色，胞浆中尼氏小体呈深蓝色，均匀分布于细胞核的周围。观察模型组和治疗组实验小鼠切片的海马区及皮层区尼氏体数量未见明显减少，神经元形态及排列与正常组比较无明显差异。提示，5月龄的Tg6799模型小鼠脑内尚未出现明显的神经元丢失。见封三彩图2。

2.2　APP/PS1双重转基因小鼠脑内额叶皮层及海马区淀粉样前体蛋白(APP)沉积的变化

各组小鼠大脑额叶皮层及海马区可见棕黄色阳性表达，主要位于细胞胞浆和胞膜而细胞核呈阴性。

从镜下观察显示,见封三彩图3。在模型组大脑额叶皮层、海马区阳性细胞明显多，胞浆着色明显加深，与模型组比较，治疗组和正常组阳性细胞数量少，胞浆着色变浅。经统计分析,见表1，与正常组和治疗组比较，模型组大脑皮层阳性面积明显增加，差异显著(P<0.01)，总光密度值增高(P<0.05或P<0.01)；模型组海马区阳性面积和总光密度均增高(P<0.05);而治疗组和正常组阳性表达相仿，但着色浅明显低于模型组，无显著性差异(P>0.05)。

表1　各组小鼠海马额叶皮层淀粉样前体蛋白APP表达的比较

注：与模型组比较,*P<0.01，▲P<0.05

3　讨论

阿尔茨海默病(AD)是一种渐进的、不可逆转的神经系统疾病和最常见一种痴呆。目前，世界上有超过3650万人受到痴呆的影响，其中大多数都是与AD有关。据估计，在老年人群中，每年有500～700万新发病例。目前临床没有任何治疗方法来预防或减缓疾病的进展[8-9]。AD的发病及病理过程是一个漫长的过程。大量的研究和临床实践表明AD的病理改变过程要早于临床诊断很多年，在AD发病后，尤其是中晚期，各种治疗方法的效果并不理想。“淀粉样蛋白级联假说”是由Hardy等[10]学者于1992年提出的，是目前较为公认的AD发病机制学说。该学说所描述的AD病理过程的进展为：APP等基因突变的发生使Aβ的产物增加并发生Aβ的凝集、沉积，之后可继发性的发生突触可塑性的破坏、小胶质细胞和星形胶质细胞的活化增生、神经元损伤、神经元内离子稳态改变、tau蛋白过度磷酸化、大量的神经元细胞死亡，最终可导致痴呆。淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)是与AD的发生、发展密切相关的一类I型跨膜蛋白，具有膜受体样结构。在生物体内的水解途径有两种，其中APP是经β分泌酶和γ分泌酶的顺次切割后形成的肽,而淀粉样蛋白(β-amyloid protein，Aβ)被认为是AD主要诱因[11-14]。APP广泛表达，尤其在神经元中有很高的浓度[15]。Shaked 等[16]提出，Aβ与APP相互作用，Aβ位于APP的疏水部分，具有很强的聚集性，易形成极难溶解的沉淀。经过一系列的级联反应，最终会引起细胞凋亡；而作用的位点正是APP上的Aβ区域。家族性阿尔茨海默病(FAD) 发生可见APP 基因突变[17]，而APP基因突变导致Aβ的生成和聚合的增加最终转人类FAD 基因的小鼠可表现为类似人类阿尔茨海默病的症状[18]。尼氏小体是神经细胞胞质内的一种物质，与神经细胞的功能密切相关，当神经细胞病变时，尼氏小体的数量减少、位置改变，甚至溶解、消失，是观察神经细胞损伤的一项指标[19]。

阿尔茨海默病是西医学病名，祖国医学传统理论中虽未出现此病的专门记载，但是根据其相关症状、病因、病机，可将其归为“健忘”“呆病”“善忘”“郁证”“颠证”等范畴。“痴呆”病名始见于汉代《华佗神医秘传》。明朝李中梓在《医宗必读》记载:“心不下交于肾，则火乱其神明，肾不上交于心，精气伏而不用，火居上则因而生 ，水居下则因而生燥，扰扰纭纭，昏而不宁。故补肾使之时上，养心使之善下，则神气清明，志意常治而何健忘之有”,说明心肾阴血亏虚，致水火不济是健忘痴呆的常见原因。林永淼等[20]认为痴呆发生主要责于心肾，心气不足肾阳虚衰神明失用、脑失所养为疾病之本。中医自古有论，《素问·四气调神大论》提到：“是故圣人不治已病治未病，不治已乱治未乱，此之谓也”。自古中医“治未病”的预防思想是中医养生保健理论的精髓之一。艾灸有防病保健的作用，《扁鹊心书》说：“保命之法，灼艾第一”，古代医家都提倡用艾灸延缓衰老。有研究报道，艾绒燃烧过程中热感可穿透机体组织以诱导肌肉生成一类热激蛋白质最终激发免疫系统，从而起到治病强身健体的作用[21]。另有艾灸通过改善血液循环、调节机体代谢和延缓衰老等功效来达到防病保健的作用[22]。而麦粒灸属于艾灸疗法中的一种，将麦粒大小艾炷，置于腧穴上点燃施灸，当艾炷燃剩2/5至1/4患者皮肤会感到微有灼痛时易炷再灸以规定数壮灸完为结束治疗，多以局部皮肤出现红晕而不起泡为度。

APP/PS1双转基因模型小鼠是大多研究学者公认的比较成功的转基因AD模型，携带突变APP和PSl基因的双转基因AD模型小鼠能够模拟AD患者脑内主要的神经病理过程及模拟AD行为学表现和病理学改变。其脑内淀粉样蛋白沉积部位与人类AD患者相似，主要存在于大脑皮层及海马。本课题采用B6SJL-Tg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)是APP/PS1双转基因模型的一种，与其它转基因AD小鼠比较，APP/PS1双转基因小鼠有APP高负荷超表达的特征，在1.5月龄小鼠的神经元胞质内可以看到Aβ1-42聚集，2月龄小鼠出现淀粉样蛋白沉积[23]。

综上所述，研究表明Tg6799双转基因AD小鼠1.5月龄时已表现APP及Aβ1-42的沉积，2月龄时老年斑随之出现，且随着年龄的增长其记忆能力越来越差，为了探究麦粒灸能否改善AD症状，笔者开始给1.5月龄AD小鼠介入麦粒灸疗法，经过9个疗程的治疗，即AD小鼠5月龄时，通过病理学和基因生物学水平实验之后，通过对小鼠脑组织切片进行尼氏体染色后发现，正常组、模型组及治疗组小鼠海马区及额叶皮层神经元形态及排列均较整齐，胞浆中尼氏小体呈深蓝色，均匀分布于细胞核的周围，尼氏体数量也均未见明显减少，表明5月龄的Tg6799小鼠脑内尚未发生明显的神经元缺失。这与近年来国内外的实验动物研究结果一致，且和“淀粉样蛋白级联假说”提出的AD病理进程中神经元损伤是由于Aβ低聚反应过程中具有神经毒性的产物导致有关记忆形成的信号传导发生障碍的理论[24]契合。经统计分析，与模型组比较，AD小鼠额叶皮层和海马区APP的表达明显减少(P<0.05)。本研究不仅肯定了麦粒灸的疗效，也丰富了中医“治未病”的理念，随着老龄化人口的增长，有必要进行更深入的研究，不仅探讨艾灸治疗AD的机制，也要将艾灸“治未病”的理念宣传教育，应用于更多AD患者。

参考文献：

[1]Zhou J,Zhang S,Zhao X,et al.Melatonin impairs NADPH oxidase assembly and decreases superoxide anion production in microglia exposed to amyloid-beta1-42[J].J Pineal Res,2008,45(2):157-165.

[2]Gevorkian G,Petrushina I,Manoutcharian K,et al.Mimotopes of conformational epitopes in fibrillar beta-amyloid[J].Journal of Neuroimmunol,2004,156(1-2):10-20.

[3]Vardy ER, Catto AJ, Hooper NM. Proteolytic mechanisms in amyloid-beta metabolism: therapeutic implications for Alzheimer's disease[J].Trends Mol Med,2005,11(10):464-472.

[4]张婧,黄祖春.早发性痴呆相关基因的研究[J].实用医学杂志,2008,24(21)：3781-3783.

[5]Liu Q,Zerbinatti CV,Zhang J,et al.Amyloid precursor protein regulats brain apolipoprotein E and cholesterol metabolism through lipoprotein receptorLRPI[J].Neuron,2007,56(1):66-78.

[6]吴琼,温咪咪,李娜,等.淀粉样前体蛋白生理功能研究进展[J].生理科学研究进展,2016,47(2):103-107.

[7]Stokin GB,Almenar-Queralt A,Gunawardena S,et al.Amyloid precursor protein-induced axonopathies are independent of amyloid-beta peptides[J].Hum Mol Genet,2008,17(22):3474-3486.

[8]Robinson M,Lee BY,Hane FT.Recent Progress in Alzheimer's Disease Research,Part 2:Genetics and Epidemiology[J].J Alzheimers Dis,2017,57(2):317-330.

[9]Norstrom E.Metabolic Processing of the amyloid precursor protein-new pieces of the Alzheimer’s puzzle[J].Discov Med,2017,23(127):269-276.

[10] Hardy JA,Higgins GA.Alzheimer’s disease:the amyloid cascade hypothesis[J].Science,1992,256(5054):184-185.

[11] Aguzzi A,Haass C.Games played by rogue proteins in prion disorders and Alzheimer’s disease[J].Science,2003,302(5646):814-818.

[12] Findeis MA.The role of amyloid beta peptide 42 in Alzheimer’s disease[J].Pharmacology therapeutics Ther 2007,116(2):266-286.

[13] Ren Z1,Schenk D,Basi GS,et al.Amyloid beta-protein precursor juxtamembrane domain regulates specificity of gamma-secretase-dependent cleavages[J].J Biol Chem,2007,282(48):35350-35360.

[14] Haass C,Selkoe DJ.Soluble protein oligomers in neurodegeneration:lessons from the Alzheimer's amyloid beta- peptide[J].Nature reviews Molecular cell biology,2007,8(2):101-112.

[15] Slunt HH,Thinakaran G,Von Koch C,et al.Expression of a ubiquitous, cross-reactive homologue of the mouse beta-amyloid precursor protein (APP)[J].J Biol Chem,1994,269(4):2637-2644.

[16] Shaked GM,Kummer MP,Lu DC,et al.Abeta induces cell death by direct interaction with its cognate extracellular domain on APP(APP 597-624)[J].FASEB J,2006,20(8):1254-1256.

[17] Nicholls JA,Wilkinson D,Holmes C,et al.Neuropathology of human Alzheimer disease after immunization with amyloid-beta peptide:a case report[J].Nat Med,2003,9(4):448-452.

[18] Goate A.Segregation of a missense mutation in the amyloid beta-protein precursor gene with familial Alzheimer’s disease[J].J Alzheimers Dis,2006,9(3 Suppl):341-347.

[19] 梁晓俐,马恒辉,卢立军,等.病理学基础与实验技术[M].北京:军事医学科学出版社,2003:112-153.

[20] 林永淼,杨有灿,林送华.老年性痴呆的中医研究[J].中医药杂志，1994(10):9.

[21] 曹云燕,蔡圣朝,袁卫华,等.督脉伏灸治未病的理论探讨及临床应用[J].上海针灸杂志,2012,31(10):771-772.

[22] 杨舟,冯国香,张国山.中医“治未病”思想指导下艾灸应用的现状和意义[J].吉林中医药,2013,33(8):841-843.

[23] Oakley H1,Cole SL,Logan S,et al.Intraneuronal beta-amyloid aggregates, neurodegeneration, and neuron loss in transgenic mice with five familial Alzheimer's disease mutations:potential factors in amyloid plaque formation[J].The Journal of Neuroscience,2006,26(40):10129-10140.

[24] 陈玉静,田金洲.ADDLs与阿尔茨海默病[J].北京中医药大学学报,2007,30(5):354-358.