气相色谱法测定己酸菌发酵液中的己酸等有机酸含量

2018-04-04袁华伟杨泽刚兰著玺刘光钱胡永奇王松涛沈才洪

酿酒科技 2018年3期

袁华伟，杨泽刚，兰著玺，游　玲，刘光钱，胡永奇，3，王松涛，3，沈才洪，3

（1.宜宾学院生命科学与食品工程学院，四川宜宾 644000； 2.泸州老窖股份有限公司，四川泸州 646000；3.国家固态酿造工程技术研究中心，四川泸州 646000）

白酒中的有机酸可以调节口味使酒体醇和爽口，更主要的是酸类物质是形成相对应的乙酯类香味成分的前体物质。不同的有机酸与醇在微生物酶的催化作用下，生成不同的酯，没有有机酸就没有相对应的酯类物质生成。其中己酸乙酯在浓香型白酒中的含量最高，对浓香型白酒的贡献也最大，是浓香型白酒的主体香味物质，也是判定浓香型白酒质量等级的关键指标[1]。同时，己酸乙酯也是酱香型白酒三大典型原酒之一的窖底香型中最突出的香味物质，赋予其芳香浓郁的显著特征[2]。在白酒特定的酿造环境下，己酸乙酯主要是在窖池内通过微生物的酯化作用合成。由己酸菌产生的己酸和酵母菌产生的乙醇生物合成[3-4]。由于己酸菌的生长速度缓慢，生长繁殖需要严格的厌氧条件，所以研究浓香型白酒中的产酸细菌重点在己酸菌[5-6]。己酸菌培养液中己酸等有机酸的组成及其含量往往随菌种的种类、纯度和发酵工艺的不同而不同，分析其中的有机酸组成与含量对开发己酸菌菌种资源、完善己酸菌发酵生产工艺条件和科学指导白酒生产都具有重要意义。因此，己酸菌在筛选、培养过程中如何快速、准确测定发酵液中的己酸等有机酸的含量是非常值得研究的。

目前测定己酸菌发酵液中己酸的方法主要有：以醋酸铜与己酸反应生成蓝色己酸铜沉淀，被乙醚抽提出来使乙醚层呈现蓝色的显色反应为原理的比色法[7-8]；己酸菌发酵液进行蒸馏后，在毛细管色谱柱上直接进样检测[9]；经乙醚萃取后用非极性毛细管色谱柱分析的气相色谱法[10]。比色法分析发酵液中的己酸含量时，培养基中醋酸钠及其他有机酸的存在对己酸定性显色反应有影响[11-12]。采用蒸馏或乙醚萃取的方法处理己酸菌发酵液，用气相色谱法测定己酸含量，可避免比色法的误差，提高分析准确度，但前处理操作复杂，并且分析时间也较长。本研究对气相色谱法测定己酸菌发酵液中己酸的方法作了改进，建立了一种利用毛细管色谱柱、直接进样气相色谱法定量测定己酸菌发酵液中的己酸、丁酸、乙酸等有机酸的方法。

1　材料与方法

1.1　材料、试剂及仪器

菌株：使用泸州老窖股份有限公司自行分离筛选自老窖泥的产己酸细菌进行己酸发酵。

己酸菌培养基（巴氏合成培养基）：(NH4)2SO40.05%、K2HPO40.04%、MgSO4·7H2O 0.02%、乙酸钠0.5%、酵母膏0.1%、CaCO31%、乙醇2%。

试剂：己酸、丁酸、乙酸、2-乙基丁酸（均为标准品），天津市光复精细化工研究所；无水乙醇（色谱纯），天津市科密欧化学试剂开发中心。准确称取己酸、丁酸、乙酸、2-乙基丁酸100 mg于100 mL容量瓶中，用25%色谱纯乙醇溶液定容至刻度。配制标准溶液的浓度为己酸1000 mg/L、丁酸1000 mg/L、乙酸1000 mg/L、2-乙基丁酸1000 mg/L。

仪器设备：色谱仪为日本岛津公司GC-2010型气相色谱仪，FID氢火焰检测器，配N2000工作站。色谱柱为日本岛津公司的Inert CapTMPure Wax毛细管柱，长30 m，内径0.25 mm，膜厚0.25 μm。

1.2　样品处理

取样品40 mL加2 M硫酸酸化至pH2，加无水乙醇至50 mL，在12000 r/min、4℃条件下进行冷冻离心5 min，取上清液，过0.2 μm微孔滤膜。进样前将样品和内标1∶1混匀。

1.3　气相色谱分析条件

采用Inert CapTMPure Wax毛细管柱，载气为高纯氮气，燃烧气为H2。内标为以25%乙醇配制的1000 mg/L的2-乙基丁酸。检测器温度260℃，汽化温度250℃，柱温150℃。进样量为0.5 μL，分流比50∶1，采样时间10 min。N2000色谱工作站，采用保留时间定性，内标法定量。

2　结果与讨论

2.1　发酵液预处理方法

直接进样毛细管柱气相色谱法分析己酸菌发酵液中的己酸等有机酸，进样的样品需达到色谱进样要求。要求进样的样品无固形物，关键要对样品进行处理。发酵培养基中添加了碳酸钙，发酵液中己酸等有机酸很大一部分以盐的形式存在，因此酸化处理己酸发酵液是必要的。己酸等有机酸沸点都比较高，不容易蒸馏出，蒸馏后的残液中己酸含量占很大部分[13]。如用盐酸酸化，盐酸与发酵液中的碳酸钙反应生成溶于水的氯化钙，样品中存在一定的盐分，对色谱柱的使用寿命有不良影响。用硫酸酸化后生成难溶于水的硫酸钙，可离心分离去除，减少样品中的盐分，确保色谱柱的正常使用。通过处理条件实验，确定己酸发酵液用2 M硫酸酸化至pH2后以12000 r/min、4℃进行高速冷冻离心5 min，取上清液，再用0.2 μm微孔滤膜过滤，所得样品直接进样分析。

2.2　色谱条件的优化

经处理后的己酸发酵液样品pH值较低，故采用具有最高惰性、键合了聚乙二醇强极性固定相的Inert CapTMPureWax毛细管柱。应用30 m×0.25 mm×0.25 μm Pure Wax毛细管柱进行气相色谱分离时，目标峰可得到较好的分离效果。

为防止气相色谱分析所用的毛细管柱被氧化，采用99.9995%的高纯氮气为载气，选择载气压力为120 kPa[14]。综合考虑己酸菌发酵液有机酸的分离度、分析时间、检测器灵敏度和歧化效应的影响，选定分流比为50∶1。由于己酸菌发酵液有机酸的组分较少，为提高分析速度、缩短分析周期，使组分快速流出色谱柱，保证有机酸组分峰具有较高的分离度，经过大量的实验对比色谱条件，选择毛细管柱的柱温150℃，汽化温度250℃，检测器温度260℃。进样量为0.5 μL，采样时间10 min。在本色谱条件下，对浓度为1000 mg/L己酸、丁酸、乙酸和2-乙基丁酸混合标准溶液进行了分析。结果显示能将己酸、丁酸、乙酸和2-乙基丁酸完全分开。混合标准色谱图见图1，己酸菌发酵液色谱图见图2。有机酸之间的分离度非常好，分离效果良好，而且色谱出峰尖锐、对称，可准确定性。气相色谱测定己酸菌发酵液中的己酸、丁酸、乙酸等有机酸分析时间在10 min以内，分离时间快，分析周期短。

图1　乙酸、丁酸、己酸混标色谱谱图

2.3　气相色谱法精密度实验

图2　己酸菌发酵液色谱图

气相色谱测定己酸、丁酸、乙酸等有机酸的方法精密度以测定待测组分含量的相对标准偏差(RSD)评价。对同一个己酸菌发酵液样品进行6次重复性测试，其己酸、丁酸、乙酸等有机酸含量的各个测定值及平均值见表1，己酸、丁酸、乙酸的相对标准偏差分别为2.54%、2.22%、2.35%，说明该方法具有较好的精密度。

2.4　加标回收率实验

分别取同一己酸菌发酵液为样品，对该样品进行加标回收试验，添加“高中低”3个浓度的己酸、丁酸、乙酸标准溶液作为加标回收试验，每个添加水平做3次平行，最后计算平均回收率，验证方法的准确度，结果见表2。通过对样品进行加标测定，由表2可得出方法加标回收率在96.83%～103.71%之间。说明该方法准确性好，可保证己酸、丁酸、乙酸等有机酸测量结果的可靠性。

2.5　己酸菌发酵液中的己酸等有机酸含量的测定

取6个己酸菌发酵液样品，分别编号为1、2、3、4、5、6，按照上述的预处理方法和分析步骤进行试验，测定结果见表3。

从上述结果可以看出，利用气相色谱法可一次性测定己酸菌发酵液中的己酸、丁酸、乙酸等有机酸含量。己酸菌发酵液样品中检测出的己酸含量在5250.46～10066.27 mg/L之间，丁酸含量在1129.78～2139.53 mg/L之间，乙酸含量在143.47～902.08 mg/L之间。

3　结论

本研究采用硫酸对己酸菌发酵液进行酸化及高速离心机、微孔滤膜过滤预处理方法，排除了发酵液中的一些物质对测定的影响。使用气相色谱法可一次性快速分析己酸菌发酵液中的己酸、丁酸、乙酸等多种有机酸组分，具有准确度高、简便快速等优点。该方法可应用于己酸菌的筛选及己酸菌的发酵控制，测定发酵液中的己酸、丁酸、乙酸等有机酸含量。