血清8b型Ⅰ群禽腺病毒的分离与鉴定

杨 振 董昌海 李 琛 马玉峰，2 倪 杰 王钜华 金文杰 钱 钟*

（1.扬州优邦生物药品有限公司，江苏扬州 225008；2.金宇生物技术股份有限公司，内蒙古呼和浩特 010030；3.扬州大学 兽医学院，江苏扬州 225009）

禽腺病毒（Fowl adenoviruses）属于腺病毒科的禽腺病毒属成员，为无囊膜的双股DNA病毒[1]。其中Ⅰ群禽腺病毒可以分为12个血清型（FAdV 1-12）。国际病毒分类委员会（ICTV）将禽腺病毒的12个血清型分为5个亚群（FAdV A-E）[2]。Ⅰ群禽腺病毒可以引起包括肉鸡[3]、蛋鸡[4]、鸭[5]以及鹅[6，7]的多种病变。不同亚群不同血清型的Ⅰ群禽腺病毒有不同的毒力，对家禽有不同的致病能力[2]。例如血清1型（FAdV-1）（FAdV-A）和血清4型（FAdV-4）（FAdV-C）主要引起禽类的肌胃糜烂或溃疡（GEU）[8，9]和心包积液肝炎综合征（HHS）。而血清2、7、8a、8b、11型则在世界范围内引起包涵体肝炎（Inclusion body hepatitis，IBH）症状[20]。

包涵体肝炎（Inclusion body hepatitis，IBH）最早于1963美国发现[10]，1976我国台湾报道，1988后辽宁、湖南、江苏、吉林、河南、内蒙古发生，2007年后又有山东、辽宁、吉林报告发生此病[11，12]。感染后发病率不高，7d～20W鸡均可发生，3～7w多发。主要发生于雏鸡，病雏生长受阻、羽毛蓬乱、蹲伏。多于48h内死亡或逐减康复。鸡群发病后会突现3～5d的死亡高峰。死亡率低，可能至10%，个别可达30%。有时病程也可持续2～3d。由于目前临床无批准的禽腺病毒疫苗，禽腺病毒的流行给养殖业带来巨大的损失。

本研究从临床采集发病鸡的肝、脾、肺等病料组织病料中分离到三株病毒。通过实验室诊断证明所分离的病毒属于Ⅰ群禽腺病毒（FAdV）成员，与GenBank参考序列进行基因序列对比发现，分离株为禽腺病毒E基因型血清8b型，分离毒株为禽腺病毒的疫苗研制提供一定的基础。

1 材料与方法

1.1 样本

2016～2017年从山东省、河南省具有典型病变的肉鸡肝、脾、肺等病料组织，其中两份为山东白羽肉鸡，1份为河南海兰褐蛋鸡；

1.2 实验动物和试剂

SPF鸡胚，种蛋购自北京梅里亚维通公司，由本公司研发中心实验室孵化；SPF鸡由本公司研发中心实验室孵化饲养；分别采集健康鸡、鸭、鹅、豚鼠、兔子全血（加抗凝剂），参照2015版《中国兽药典》附录中“红细胞悬液制备法”进行配制；Taq酶、RNA酶、dNTP、DNA marker购自南京诺唯赞生物技术有限公司；PCR扩增仪为eppendorf公司产品；扩增禽腺病毒 Hexon基因的特异性通用引物：FAdV-F：5’-AAT GTC CAN ACC GAR AAG GC-3’和FAdV-R：5’- CBG CBT RCA TGT ACT GGT A -3’，目的条带大小为830bp。0.22μm滤器购自美国Millipore。

1.3 病毒的分离及培养

病毒分离和传代 取病死鸡肝、脾组织，剪碎，按1：5加入灭菌PBS溶液，研磨，匀浆，-70℃反复冻融3次，12000 r/min离心10min，取上清液用0.22μm滤膜过滤，经绒毛尿囊膜接种7日龄SPF鸡胚，0.2 ml/枚，每组5枚，同时设对照组鸡胚2枚，置37℃孵育。弃去24h内死亡的鸡胚，将24h以后死亡的鸡胚置4℃冰箱，收集尿囊液进行血凝试验，同时收取胚体和绒尿膜，无菌研磨后分装，-70℃冷冻保存备用。将收获的尿囊液和绒尿膜以及胚体研磨液100倍稀释后，经绒毛尿囊膜接种7日龄SPF鸡胚进行传代。

1.4 病毒动物回归试验

取40只21日龄健康 SPF鸡，分开饲养。实验组三组分别颈部皮下注射100倍稀释的病毒液0.2ml，对照组每只注射同等剂量的无菌生理盐水。每天观察鸡状况。死亡鸡剖检，取肝、脾组织进行病毒鉴定。

1.5 病毒红细胞凝集实验

分别取上述不同来源分离株，浓缩2倍制备成待检病毒液。按照现行《中国兽药典》附录中的“红细胞凝集实验法”，分别对鸡、鸭、鹅、豚鼠、兔子的1%红细胞悬液进行凝集实验。

1.6 病毒目的基因测定及分析

按照参考文献[2]所述的方法提取各分离株的基因组。以基因组DNA为模板，禽腺病毒 Hexon基因的特异性引物进行扩增。反应条件如下：95℃预变性5min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；最后进行72℃延伸10min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶（1.0g/L）电泳进行鉴定，阳性的样品目的序列克隆后送南京金斯瑞生物科技有限公司测序，每份样本进行三次测序，并对测定的序列结果进行BLAST（网址：http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）搜索分析。

2 结果

2.1 病毒分离和培养

三份病料分别接种SPF鸡胚后，实验组鸡胚在120～240h内死亡，未接种的对照鸡胚均健康存活。与对照鸡胚相比，感染胚可见绒毛尿囊膜水肿增厚，胚体全身严重出血，多数胚胎的肝发黄，有的有出血点（图1）。每组病死鸡胚尿囊液清澈，分别收获后取样菌检，均无细菌和霉菌生长。病毒在SPF鸡胚传代，每代均能致鸡胚死亡。

2.2 动物回归实验

分离株病毒分别接种21日龄SPF鸡后，在72h后开始发病，发病时相继出现精神沉郁，翅膀下垂，羽毛蓬乱，屈腿蹲立（图2），病死鸡剖检可见肿大，边缘钝厚，表面有大小不等出血点、条、斑，黄白色点状、斑状坏死灶，色泽偏黄，也可见少量心包积液。与临床发病鸡症状一致。实验组死亡率为30%～70%，对照组正常，PCR检测实验组鸡，禽腺病毒阳性率100%。

图1 病料接种SPF鸡胚胚体病变照

图2 SPF鸡攻毒实验病变图

2.3 红细胞凝集实验

分离的病毒株对鸡、鸭、鹅、豚鼠、兔子的1%红细胞悬液均无血凝性。

2.4 序列测定及分析

2.5 禽腺病毒目的基因扩增及鉴定

各分离株Hexon基因扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分析，均可见约830bp的目的条带，DNA大小与预期的结果相符（图3）。将扩增的目的片段送南京金斯瑞生物科技有限公司测序，对结果分析显示，分离株Hexon基因序列均与GenBank数据库中的参考株禽腺病毒最为相近，与参考序列FAdV-8b核苷酸同源性为97.1%～99.1%（图3），分离株之间的核苷酸同源性为99.5%～100%。

图3 分离株病毒PCR鉴定结果和同源性分析

2.6 目的基因序列分析

将分离株目的基因与参考序列基因使用MEGA.5[13]软件构建序列进化树，结果显示分离的病毒与E基因型禽腺病毒血清8b型参考序列处于同一个分支（图5），结果表明分离的病毒为禽腺病毒血清8b型。

图5 各分离株Hexon基因序列与参考基因序列进化树分析（Neighbor-joining，1000 replicates）

3 结果与讨论

本研究通过PCR 扩增、序列分析和动物试验，分离了3株病毒，最终确诊病毒为血清8b型FAdV。使用针对Ⅰ群FAdV 的Hexon基因特异性引物可以对所有Ⅰ群FAdV进行检测，测序分析后可进行基因型和血清型的区分[14]。对分离株病毒经基因分析发现分离株与Ⅰ群FAdV基因E型血清8b型参考毒株同处一个进化树分支，亲缘关系较近，与参考株的同源性为97.1%～99.1，分离株之间的核苷酸同源性为99.5%～100%，表明不同地区流行的Ⅰ群禽腺病毒为同一个血清型。Ⅰ群FAdV大多在肉鸡上发生于3-5周龄，偶尔会感染10-20周龄左右蛋鸡和种鸡[15]。本研究中，山东和河南分离株分别分离自商品白羽肉鸡和蛋鸡，发病日龄在三周内，表明该病毒可以感染不同品种的鸡群。符合该病的流行病学特点。

根据之前报道[16]，我们通过绒毛尿囊膜（CAM）途径接种鸡胚进行禽腺病毒FAdV-4的分离，第一代即可成功分离，获得的病毒毒价高，并能在SPF鸡胚上稳定传代。本文中我们使用同样方法进行病毒分离，成功分离到三株病毒。病毒凝集对鸡、鸭、鹅、豚鼠、兔子的1%红细胞悬液均无血凝性，据报道[17]，Ⅰ群禽腺病毒中仅FAdV-1能凝集大鼠红细胞和绵羊红细胞，但目前还没有证据表明禽的Ⅰ群腺病毒的其他血清型能凝集动物的红细胞。值得注意的是，分离株SD16和HN16对7日龄SPF鸡胚10d内致死率为70%左右，而分离株SD17对7日龄SPF鸡胚10天内致死率达到98%，提示临床上FAdV-8b野毒株有毒力增强的可能，这需要我们对分离株进一步的研究。

取三株病毒分别皮下接种21日龄SPF鸡（100ELD50/0.2ml），实验组死亡率为30%～70%，对照组正常，PCR检测所有实验组鸡，禽腺病毒阳性率100%。病鸡羽毛蓬乱、蹲伏。解剖可见肝肿大，表面有大小不等出血点、条、斑，黄白色点状、斑状坏死灶，色泽变淡。也可见少量心包积液。这与临床发病症状是一致的。心包积液可能是急性炎症反应时心包内炎性渗出物转化为纤维蛋白性渗出液导致，这可能与鸡感染后急性发病死亡有关[18]，有的学者认为还有其他病原的参与[17]。因禽腺病毒在鸡群中广泛存在且同一只鸡经常会感染多个血清型的禽腺病毒[19]，心包积液也可能是其他血清型禽腺病毒混合感染的结果。

目前，Ⅰ群禽腺病毒致病机理以及在我国的流行原因并不是很明确，因引起包涵体肝炎的有多个血清型如FAdV-E的血清型FAdV-7、FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-D的血清型FAdV-2、FAdV-11[20]，临床对包涵体肝炎的防控有很大的挑战性。我国目前主要流行的是FAdV-4C和FAdV-8b，前者可引起心包积液肝炎综合征，FAdV-11d也有报道[15]。由于临床目前无批准的疫苗，禽腺病毒给养殖业带来巨大威胁。据国外研究报道，使用疫苗可以有效防控该病，如在6～30周龄使用FAdV-8b疫苗可以有效地防控肉（种）鸡包涵体肝炎[21]。由于该病毒可垂直传播，若种鸡产蛋期带毒，可大大增加商品鸡发病率和死亡率。有报道指出，在肉种鸡29周时肌肉注射免疫FAdV-8b疫苗，在免疫2周后产的种蛋孵化出的商品鸡死亡率和发病率明显降低[22，23]。因此。开发针对禽腺病毒的疫苗对防控该病具有重要意义。本研究对禽腺病毒的初步研究为疫苗的开发提供一定的理论基础。

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