HPLC法同时测定茵栀解毒颗粒中绿原酸、栀子苷和黄芩苷的含量

（安徽省兽药饲料监察所，安徽合肥 230091）

茵栀解毒颗粒收载于《兽药质量标准》[1]2017年版（中药卷），主要由茵陈、栀子、黄芩、虎杖、钩藤5味中药材组成，具有清热解毒，疏肝解痉功能，主治雏鸭病毒性肝炎[2]。其质量标准中只规定了绿原酸的含量测定，栀子、黄芩也起很大作用，但未规定测定其活性成分，本实验利用高效液相色谱仪，采用梯度洗脱法，同时测定了组方中茵陈、栀子、黄芩中的活性成分含量，为完善该制剂的质量标准提供参考。

1 仪器与试药

美国Agilent公司高效液相色谱仪：型号HP 1100，配四联梯度泵、在线脱气机、二极管阵列紫外检测器（DAD）、自动进样器和柱温箱；十万分之一天平：德国赛多利斯，感量0.01mg，型号BS21S；

对照品：绿原酸（批号Z0261407 含量97.3%）、栀子苷（批号Z0261706含量97.3%）、黄芩苷（批号：Z0271705含量96.8%），均购自中国兽医药品监察所；茵栀解毒颗粒（安徽奥力欣生物科技有限公司，批号：20171001）；乙腈、甲醇均为色谱纯，美国FISHER Chemical公司，磷酸：分析纯，上海试剂公司，超纯水：水质可达18.3MΩ·cm。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备

精密称取绿原酸25.91mg、栀子苷25.35mg、黄芩苷24.85mg对照品于100ml容量瓶，加50%甲醇溶解，制成储备液，分别精密量取绿原酸、栀子苷、黄芩苷储备液5ml于50ml容量瓶混合，加50%甲醇定溶，制成工作液。

2.1.2 供试品溶液的制备

取茵栀解毒颗粒（批号：20171001）0.7g，精密称定，置10mL容量瓶，加热水8ml溶解，凉至室温，加甲醇定容至刻度，经0.45μm滤膜过滤，取续滤液，即得。

图1 对照品色谱图

2.2 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Waters公司Symmetry C18（4.6 ×250mm，5μm）；流动相：以乙腈为流动相A，以0.025mol/L磷酸溶液为流动相B，四元梯度泵在线配制，按表1规定进行梯度洗脱；流速1.0mL/min；测定波长：240nm；柱温：25℃；进样量：10μl，记录色谱图，在此条件下，对照品溶液色谱主峰保留时间与供试品保留时间一致，分离度大于1.5，理论塔板数大于5000，结果见色谱图1。

图2 样品色谱图

表1 梯度洗脱程序

3 方法学考察

3.1 线性关系考察

自动进样器吸取工作液2、5、10、10、20、40μl注入HPLC，以对照品溶液浓度（μg/ml）X与其所得峰面积Y作标准曲线图，绿原酸的回归方程和线性范围为Y=15.77X-5.74、5.04～100.84μg/ml（r=0.9998）；栀子苷回归方程和线性范围为Y=14.71X-5.76、5.07～100.14μg/mL（r=0.9998）；黄芩苷回归方程和线性范围为Y=9.29X-0.317、4.81～96.20μg/ml（r=0.9999），此范围内峰面积呈良好线性关系。

3.2 精密度试验

取对照品工作液，按2.2色谱条件连续进样6次，测定对照品工作液中绿原酸、栀子苷、黄芩苷的峰面积，RSD为0.34%、0.46%、0.53%（n=6），保留时间的RSD均小于1%，表明分析方法符合精密度的要求。

3.3 稳定性试验

取供试品溶液，在室温下放置1、6、12、24、48h后，测定试样中绿原酸、栀子苷、黄芩苷的峰面积，RSD为0.44%、0.68%、0.86%（n=5）。

3.4 重复性试验

取茵栀解毒颗粒（批号：20171001），按2.1.2方法制备6份平行样，按2.2色谱条件注入HPLC，测定样品中绿原酸、栀子苷、黄芩苷的峰面积，RSD分别为0.31%、0.42%、0.50%（n=6），保留时间的RSD均小于2%。

3.5 样品测定

取茵栀解毒颗粒，每批按2.1.2方法制备3份平行样，按2.2色谱条件注入HPLC，测定样品中绿原酸、栀子苷、黄芩苷的峰面积，外标法计算样品含量，结果绿原酸、栀子苷、黄芩苷分别为3.51、2.45、3.73（mg/g）。

4 结果与讨论

4.1 样品的处理方法

本试验与《兽药质量标准》2017年版（中药卷）规定有较大改进，试样用0.1冰醋酸溶液直接溶解，绿原酸、栀子苷能够提取出来，黄芩苷不易提取出来，改进先用80%热水溶解，后用甲醇定容，能将3种有效成分提取出来。

4.2 流动相的选择

有文献报道[3]用甲醇、磷酸溶液作为流动相，经试验发现，绿原酸、栀子苷、黄芩苷3种成分分离度达不到要求，杂质有干扰。以乙腈、0.025mol/L磷酸溶液进行梯度洗脱能够缩短分析周期，增加灵敏度，提高分离度同时使峰型得到改善，减少拖尾和杂质干扰。

4.3 波长的选择

经二极管阵列紫外检测器（DAD）全波长扫描，栀子苷、绿原酸、黄芩苷在240nm处3种物质有很好的吸收，采用DAD检测器带宽设定在4～8nm，参比波长选择靠近测定波长附近，以扣除空白溶液影响。

本研究建立了HPLC同时测定茵栀解毒颗粒中绿原酸、栀子苷和黄芩苷的含量方法，通过试验，本方法精密度高，重复性好，操作简便，适用于茵栀解毒颗粒的质量控制。

[1]中国兽药典委员会.兽药质量标准 中药卷 [M].中国农业出版社，2017.

[2]兰新财，赵丽丽，叶志惠，等.茵栀解毒颗粒保护肝损伤药理作用的研究[J].中国兽药杂志，2017，51（6）：56-63.

[3]鲁晓蓉，桂双英.HPLC法测定茵栀黄软胶囊的含量[J].安徽医药，2008，12（4）：313-314.