循环肿瘤细胞研究进展及其在胰腺癌诊疗中的应用
2018-04-02
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(1复旦大学附属中山医院介入治疗科 上海 200032; 2上海市影像医学研究所 上海 200032)
循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)是一种由原发肿瘤组织脱落入血循环的肿瘤细胞[1]。CTCs进入血液循环后,绝大部分经脱巢凋亡(anoikis)、血流剪应力和机体免疫识别杀伤,最终能在外周血中存活的CTCs数量很少,通常为1～102/mL(白细胞数量为105～106/mL,红细胞数量为109～1010/mL)。目前研究认为,CTCs和多个CTCs形成的团簇在肿瘤转移中起到关键作用[2]。CTCs在传播过程中的表面抗原、基因型及其病理学表征是当前癌症转移机制的研究要点。以CTCs技术为代表的“液体活检”取样简易且微创,能更好地代表肿瘤的异质性,已被视为一种新型的肿瘤生物标记物。CTCs计数、计数变化、亚群特征等与患者预后密切相关,并与个体化治疗建立起越来越多的联系。利用CTCs的功能性诊断结果建立个性化癌症治疗方案,是实现癌症精准用药重要而可靠的途径。本文就CTCs的研究进展及其在胰腺癌诊疗中的应用作一综述。
CTCs的分离CTCs的分离方法按照分离原理可以分为生物法和物理法两大类[3]。生物法利用CTCs不同于其他血细胞(白细胞、红细胞、血小板)的表面抗原,物理方法则根据CTCs与其他血细胞在密度、尺寸、变形性方面的差异。将患者血样中的红细胞裂解后,采用表面固定的EpCAM抗体直接识别并捕获表达EpCAM抗原的CTCs,获得的CTCs即可进行显色分析,这种分离方法属于生物法中的阳性富集。CellSearch系统是这一分离技术的代表,是目前唯一经FDA认准用于转移性乳腺癌、结肠癌和前列腺癌预后判断的CTCs分离系统[4-6]。使用表面带有白细胞特异性抗体的磁珠吸附白细胞,获得未标记的CTCs悬浮液,这种方法又称为生物法中的阴性富集[7]。物理法中,OncoQuick系统不依赖抗原的识别,而是通过CTCs和其他血细胞的密度不同加以分离,因此可以获得EpCAM阳性和阴性的CTCs[8]。MetaCell系统的技术核心是利用CTCs的直径大于其他血细胞的特点,将血样通过孔径为8 μm的聚碳酸脂膜,过滤分离CTCs[9]。Hou等[10]根据流体力学原理设计了螺旋形微管道,通过惯性微流与Dean环流的耦合分离CTCs与白细胞。Yeo等[11]在这一基础上,进一步设计了能分离出单个CTC的微流控设备,使获得的CTCs可以直接用于下游分子生物学检测。目前,也有纳米技术应用于CTCs分离的报道。Halo等[12]将与CTCs中特定基因(如TWIST) mRNA互补的单链DNA附着于金纳米颗粒表面,当纳米颗粒进入CTCs时,两者结合时释放荧光,根据荧光强度可半定量检测CTCs。需要注意的是,不同原理、不同的分离体系的CTCs检出率和纯度会相差很大。如Kaifi等[13]的研究中,同时使用基于抗原的CellSearch系统和基于尺寸的FMSA系统分别检测围术期CTCs时,FMSA系统的检测率高达93.4%,CTCs平均数为22.56个/7.5 mL,而CellSearch系统仅为26.1%和0.87个/7.5 mL。基于抗原识别的生物方法具有高纯度的优势,但会遗漏不表达相应抗原的CTCs,而且因抗原抗体的作用,有可能影响下游功能检测;基于密度和尺寸的物理分离方法,不受CTCs表面抗原表达的影响,检出率较高,但因可能混杂其他血细胞而导致纯度较低。CTCs分离技术发展很快,很多较成熟的体系已经具备较快的样品处理速度和较高的检出率、检出纯度。目前急需的是相应的技术规范和操作标准,以便临床应用研究和实验研究的规范化和标准化。
CTCs的分子生物学特征随着CTCs分离技术的不断改良,基因组学、转录组学、蛋白质组学等生物学成果的涌现,为揭示CTCs的分子生物学特征及其在肿瘤转移发生发展中的作用提供了可能。
上皮-间质转化 上皮-间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)是指上皮细胞通过特定程序转化为间质表型细胞的生物学过程[14]。在这个过程中,肿瘤细胞失去极性、黏附性等上皮表型,转化为具有较高运动、侵袭能力的间质表型,从而大大提升了肿瘤细胞侵袭转移的能力[15]。现有研究表明,上皮细胞源性肿瘤细胞在SNAI1、ZEB、MMP9、TWIST等家族转录因子作用下,E-钙黏蛋白表达受到抑制,发生EMT,失去极性与细胞黏附性,从原位肿瘤组织脱落并进入血液循环系统[16]。进入循环系统的CTCs大部分发生凋亡,或在免疫编辑作用下进入休眠状态,24 h后仅约0.1%的CTCs仍存活,其中不足1/10具有致瘤性[17]。EMT是一个受多种因子和信号通路调控的复杂过程,它的具体机制还有待于进一步研究加以阐明。IL-6长期以来被认为有促进结直肠恶性肿瘤EMT的功能。Liu等[18]证实了fos相关抗原-1 (Fra-1)和信号转导及转录激活子3 (singnal transducer and activator of transciption 3,STAT3)共同调控IL-6诱导EMT过程。在用RNA干预STAT3或IL-6的表达后,EMT、细胞迁移、组织侵犯等现象都受到阻碍。转录因子NF-κB调控广泛的生物过程,包括炎症反应、细胞扩增、细胞凋亡等。Maier等[19]发现NF-κB受抑制时,转变生长因子β (transforming growth factor-β,TGF-β)诱导的EMT无法发生,而活化NF-κB后,细胞呈现出波形蛋白和ZEB1的上调控及E-钙黏蛋白的下调控等EMT特征。Gu等[20]发现肺癌细胞中IL-17经NF-κB介导上调控ZEB1,诱发EMT。基于对EMT的调节信号网络结构分析,Chanrion等[21]提出并验证了p53的丢失和Notch激活协同诱导EMT。Yang等[22]发现岩藻糖转移酶能激活P13K/Akt和NF-κB通路,进一步激活SNAI1和MMP-9诱导EMT。Salnikov等[23]证明低氧环境会正调节EMT相关基因,使得E-钙黏蛋白表达量降低,波形蛋白表达量升高。Zheng等[24]利用敲除了Snai1或Twist的基因工程鼠,证明了EMT的抑制并不改变胰管腺癌的发生、扩散和转移,但导致均衡核苷转运蛋白和集中核苷转运蛋白过表达,进而提高了对化疗药物吉西他滨的敏感性和整体存活率。
CTCs的保护机制 进入血液系统,CTCs将受到血液剪应力、免疫细胞杀伤等灭活作用。在传播过程中CTCs采取多种机制自我保护,包括利用血小板为保护屏障、回避免疫识别等方式。肿瘤细胞在血液中与血小板聚合,可抵御血液流动的剪应力。Zheng等[25]发现血小板和肿瘤细胞均表达纤维蛋白原的主要受体——β整合蛋白,纤维蛋白原能将两者桥连,加强两者的结合,促进对CTCs的保护。肝素及其化学衍生物可以抑制纤维蛋白原与β整合蛋白的结合,具有发展为抗癌症转移药物的潜力。免疫识别方面,CD47是一种广泛表达的跨膜蛋白,可与巨噬细胞、树突细胞等表达的单调控蛋白α结合抑制其吞噬作用,Willingham等[26]系统地分析了人体各部位(包括卵巢、乳腺、结肠、膀胱、前列腺等)恶性肿瘤细胞的CD47表达量,发现肿瘤细胞的CD47表达量平均约为相应正常细胞的3.3倍。同一研究发现CD47 mRNA水平与患者无进展生存期(progression-free survival,PFS)负相关,而抗CD47抗体使吞噬作用恢复,进一步证明了CD47的高表达能够降低免疫系统对CTCs的杀伤。单核细胞趋化蛋白-1 (monocyte chemoattractant protein 1,MCP-1)是一种能够吸引自然杀伤细胞(natural killer cells,NK)、记忆T淋巴细胞等免疫细胞的趋化因子,与肿瘤的生长与扩散相关。Mardani等[27]分析比较了健康志愿者、良性/恶性唾液腺肿瘤患者血清样品中的MCP-1浓度,发现高进展患者的血样中MCP-1浓度较低,认为低浓度MCP-1为肿瘤的扩散提供了有利条件。NK细胞是一类通过穿孔蛋白和颗粒酶直接杀死肿瘤细胞,或通过调控干扰素γ (interferon γ,IFN-γ)、肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor α,TNF-α)等因子间接消灭肿瘤细胞的免疫细胞,是人体免疫系统中重要的抗癌细胞,其激活依赖于多种蛋白质受体。Rocca等[28]发现外周血中NK细胞表面的CD16、NKG2D、DNAM-1、CD161、NKp46、NKp30等激活受体表达受到负调节,而CD85j、NKG2A等抑制受体受到正调节,使得NK细胞的细胞毒性作用与IFN-γ分泌量均下降,推测在癌症扩散过程中,NK细胞活性降低导致循环系统中肿瘤细胞的存活能力增强。蛋白酶激活受体-1 (protease activated receptors-1,PAR-1)在乳腺癌、前列腺癌、黑素瘤细胞等表面的过表达也与其转移能力增强相关。Villares等[29]发现PAR-1负调控乳腺丝抑蛋白质的水平,而后者能增加肿瘤细胞的细胞凋亡、减少肿瘤血管生成。在充分了解CTCs躲避免疫系统攻击的分子水平机制后,有可能利用人体自身免疫干预肿瘤转移的发生和发展。
异质性 肿瘤组织具有异质性(如突变位点、细胞表型不同),CTCs不仅具有同样的异质性,还可能成为研究肿瘤异质性的有效工具。Li等[30]以角蛋白8、18、19及EpCAM为上皮细胞(E)标志物,以波形蛋白和TWIST为间质细胞(M)标志物,对胃癌患者CTCs进行染色,将CTCs分为5类(E,E>M,E=M,E
干细胞特征 研究表明,CTCs中只有少部分细胞能够形成肿瘤,这些细胞被认为具有干性,或称为肿瘤干细胞(cancer stem cell,CSC)。CD133被视为胰腺癌干细胞标记物,Nomura等[35]研究CD133过表达的胰腺癌细胞,发现诸多被认为与干性相联系的基因(如KITLG、LIN28B、MYC、SOX2等基因)以及与EMT相关的基因,(如SNAI1、ZEB1、MMP9等)均上调;CD133过表达的细胞用于异种移植时,成瘤率和肿瘤生长速率均显著提升。Grillet等[36]将转移性结直肠癌患者CTCs建株,检测到其ALDH1A1、CD133、EpCAM、CD26、CD44v6等蛋白质高含量,结合极限稀释分析结果,认为所得细胞株中CSC的比例低于5%。Salnikov等[24]在多种恶性肿瘤(如胰管腺癌、乳腺癌、肺癌等)中,发现低氧标志物HIF-2α阳性区域也是CD133阳性区域。他们还证明低氧环境能提高肿瘤细胞的迁移能力,而将肿瘤细胞按分化程度、p53突变、群落形成能力等参数划分为CSC高表达亚群和CSC低表达亚群后,发现CSC高表达亚群的基础迁移能力与低氧诱导的迁移能力均高于CSC低表达亚群,由此认为CSC是组织侵入和癌症转移的根源。CSC具有特殊的增殖能力和抗药性,在癌症扩散和复发中都起到关键作用。以CTCs为载体系统地研究CSC是肿瘤生物学今后发展的重中之重。
CTCs的培养扩增临床血样中可采集到的CTCs数量极少,除能进行细胞计数与基因测序外,通常不足以用于常规的药敏性测试或细胞表型分析,故CTCs的稳定培养扩增是CTCs下游功能的分析的基础。同时,在细胞数量很少的情况下,细胞间的旁分泌信号匮乏,会增加细胞培养扩增的困难。 Yu等[37]通过CTC-ichip采集雌激素受体阳性乳腺癌患者的CTCs,用加入了表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、基本纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、B27添加剂的RPMI-1640培养基,在超低黏附多孔板中及低氧(4%O2)条件下,成功将17.14% (6/35)的样品CTCs增殖,倍增时间为3天至3周,同时还报道了贴壁会诱使CTCs衰老这一现象。Cayrefourcq等[38]用CellSearch系统采集转移性结直肠恶性腺癌患者的CTCs悬浮培养,先置于加入了胰岛素、左旋谷氨酸盐、EGF、FGF-2、N2添加剂、少量胚胎牛血清的DMEM/F12培养基中,低氧(2%O2)条件下培养,后转移到加入了EGF、FGF-2、胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂的RPMI-1640培养基中,常氧条件下培养,得到能够长期存活的细胞株。Gao等[39]用Ficoll®Paque系统离心得到转移性前列腺癌患者的CTCs,分散在Matrigel中为类器官,浸泡于加入了多种添加剂的DMEM/F12培养基中,将5.88% (1/17)的样品成功扩增,倍增时间为1周,突变情况和结构分别与原位肿瘤细胞和组织相似。Zhang等[40]用CTC-chip固定早期肺癌患者外周血中的CTCs,先在芯片上加入纤维组织母细胞和胶原、Matrigel,浸泡在添加了胎牛血清的RPMI-1640培养基中3D-共培养1周,肿瘤细胞数量平均提高到8倍;后将细胞从芯片上释放转移到多孔板中继续培养1周,肿瘤细胞数量平均提高到54倍,总培养成功率为73.68% (14/19)。CTCs培养成功率普遍较低是目前面临的学术难题。目前尚无适用于所有不同来源肿瘤细胞培养的“金标准”,但每一类肿瘤CTCs的成功培养,都将极大地推进肿瘤转移发生发展的研究和相关临床治疗。
CTCs在胰腺癌诊疗中的应用中国肿瘤登记中心最新发布结果显示,2000年至2011年间我国胰腺癌发病率与死亡率逐年攀升,预计2015年全国新发胰腺癌约9万例,死亡约8万例[41]。早期诊断困难与缺乏有效的个体化治疗方案是导致胰腺癌预后极差的重要原因。80%左右的患者确诊时已发生肿瘤外周侵袭或远处转移,无法进行手术治疗[42]。CA19-9是临床最重要的胰腺癌血清生物学标记,但敏感性和特异性仅为80%和82%,部分胰腺癌患者CA19-9水平不升高,部分良性疾病(如胰腺炎、胆道梗阻)患者会出现CA19-9水平升高的假阳性[43]。因此,需要寻找新的有效的生物标志物,不仅可以用于胰腺癌的早期诊断,而且可以监测疗效,指导临床治疗。CTCs作为液体活检的重要组成部分,是目前临床研究的热点。胰腺的静脉血首先经门静脉系统回流至肝脏,然后再到达体循环,外周血CTCs明显少于乳腺癌、前列腺癌等肿瘤。胰腺癌基质丰富,肿瘤细胞所占比例较少,因此外周血中的CTCs也少于同样经门静脉回流的结直肠癌、胃癌[44]。部分研究因胰腺癌CTCs检出率低、单位血样中CTCs计数少,而未能得出有意义的结论[45]。
诊断和分期 Kulemann等[46]用Screencell系统检测的一组胰腺癌病例中,75.0%的早期患者(AJCC分期≤ⅡB期)CTCs阳性,71.4%的晚期患者(AJCC分期≥Ⅲ期)CTCs阳性。因此CTCs并不只出现于转移或晚期患者,胰腺癌的不同分期都可以出现CTCs。Zhang等[47]采用CK、CD45、DAPI和CEP8(染色体着丝粒探针8)作为标志物检测了22例胰腺癌、3例胰腺实性假乳头状瘤、6例胰腺良性肿瘤患者和30例健康志愿者。将CK(+)、CD45(+)、DAPI(+)和CEP≥2作为胰腺癌CTCs标准时,CTCs计数≥2个/3.75 mL诊断胰腺癌的敏感性和特异性分别达到68.18%和94.87%。Zhou等[48]检测C-MET、h-TERT、CK20和CEA基因在胰腺癌CTCs中的表达分别为80%、100%、84%和80%,而在正常体细胞中为0、0、6.7%和0。如将上述4个基因表达同时作为胰腺癌CTCs标准时,诊断的敏感性和特异性均可以达到100%。Ankeny等[49]检测72例胰腺癌患者和28例其他胰腺疾病患者的CTCs,显示Ⅰ～Ⅱ期患者CTCs阳性率为54.84% (17/31)、Ⅲ期阳性率为78.57% (11/14)、Ⅳ期阳性率为96.30% (26/27);28例其他胰腺疾病患者中仅1例检测出了1个CTCs;统计表明可以将CTCs≥3个/4 mL作为Ⅳ期胰腺癌的评判标准。CTCs有望成为胰腺癌诊断和分期的生物学标志。
疗效和预后 Sheng等[50]观察了3例接受化疗的Ⅳ期胰腺癌患者,采用CT进行疗效随访的同时,检测患者的CTCs。当CT显示治疗有效、病灶缩小时,CTCs计数同时下降。因此CTCs计数有可能成为比CT损伤更小的疗效观察指标。Khoja等[51]分别用CellSearch系统(根据上皮表型-EpCAM/CK富集CTCs)和ISET系统(根据细胞大小富集CTCs)获取54例胰腺癌患者的CTCs,ISET系统的CTCs检出率为93%,明显高于CellSearch系统的40%,ISET系统检测的CTCs中位值为9个/7.5 mL,亦明显高于CellSearch系统的0个/7.5 mL。这一研究结果表明,CTCs中仅一小部分具有上皮表型,EMT过程使部分CTCs丧失了上皮表型,同时获得间质表型。只有对所有表型的CTCs进行分析,才能更好地研究肿瘤的异质性。采用CTCs评价患者预后时,应考虑CTCs的EMT现象,也就是不能仅分析上皮表型的CTCs,还应考虑间质表型的CTCs。Poruk等[52]分析了50例胰腺癌患者(其中44例接受外科手术)的CTCs,分别观察具有上皮表型(角蛋白阳性)和间质表型(波形蛋白阳性)的CTCs对患者预后的影响。他们发现,上皮表型CTCs阳性预示患者生存期较短,间质表型CTCs与术后复发相关,检测到间质表型CTCs的患者中位复发时间为9.5个月,而间质表型CTCs阴性的患者则为13.5个月。
胰腺癌CTCs的分子生物学 虽然,目前有关胰腺癌CTCs分子生物特征的研究很少,但是这些报道仍显示出乐观的研究前景。黏蛋白-1(Mucin-1)是一种和肿瘤转移有关的跨膜糖蛋白,它的表达预示患者预后较差。目前,已有针对黏蛋白-1的IgG抗体应用于临床,但是有时病灶穿刺活检的样本量太少,无法进行黏蛋白-1的测定。Dotan等[53]对23例CTCs阳性的患者进行了黏蛋白-1表达的观察,发现10例(43%)黏蛋白-1阳性,黏蛋白-1阳性患者的中位生存期2.7个月,明显低于黏蛋白-1阴性患者的9.6个月(P=0.044)。因此,通过对CTCs的黏蛋白-1表达分析,可以指导临床用药。Court等[54]采用Sanger测序技术对获取的胰腺癌CTCs进行单细胞测序,在12例患者获取的119个CTCs中有33个检测到了KRAS突变,KRAS突变检出率达到了27.7%。并认为当CTCs数量达到10个以上时,可以用这一单细胞测序技术得到KRAS突变阳性结果。Sergeant 等[55]对CTCs的基因表达进行了深入研究,他们从6例接受手术切除的胰腺癌患者获得CTCs行RNA扩增后,进行全基因组测序,并和原发肿瘤、血细胞和胰腺组织对比。结果发现CTCs有1 059个基因异常表达,与肿瘤细胞迁移有关的细胞分裂激活激酶p38(p38MAPK)信号通路上调。而且和肿瘤细胞迁移和运动相关基因高表达的数量,直接和患者的无病生存期和总生存期有关。
结语CTCs是探究癌症发生转移机制的理想对象,近年来受到临床热切关注;CTCs的特征与癌症预后紧密联系,有极大的临床意义。随着研究方法的不断进步,对CTCs的认识也从简单的数量鉴定步入对分子层面的研究。其中,CTCs所表现出的干细胞特征、异质性、免疫逃避机制等特征及其相关的后续临床应用,对胰腺癌的早期筛查、精准治疗和预后判断都有显著价值。CTCs在临床上的推广运用仍需要对分离获取方法的标准性、功能性分析的可靠性和前瞻研究的有效性进行更加深入和细致的探究,相信该领域将会是肿瘤学研究的重点之一。
[1] NAGRATH S,SEQUIST LV,MAHESWARAN S,etal.Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology [J].Nature,2007,450(7173):1235-1239.
[2] ACETO N,BARDIA A,MIYAMOTO DT,etal.Circulating tumor cell clusters are oligoclonal precursors of breast cancer metastasis [J].Cell,2014,158(5):1110-1122.
[3] HAROUAKA R,KANG Z,ZHENG SY,etal.Circulating tumor cells:advances in isolation and analysis,and challenges for clinical applications [J].PharmacolTher,2014,141(2):209-221.
[4] WONG SC,CHAN CM,MA BB,etal.Clinical significance of cytokeratin 20-positive circulating tumor cells detected by a refined immunomagnetic enrichment assay in colorectal cancer patients[J].ClinCancerRes,2009,15(3):1005-1012.
[5] PACHMANN K,CAMARA O,KAVALLARIS A,etal.Monitoring the response of circulating epithelial tumor cells to adjuvant chemotherapy in breast cancer allows detection of patients at risk of early relapse [J].JClinOncol,2008,26(8):1208-1215.
[6] MORGAN TM,LANGE PH,PORTER MP,etal.Disseminated tumor cells in prostate cancer patients after radical prostatectomy and without evidence of disease predicts biochemical recurrence [J].ClinCancerRes,2009,15(2):677-683.
[7] KARABACAK NM,SPUHLER PS,FACHIN F,etal.Microfluidic,marker-free isolation of circulating tumor cells from blood samples [J].NatProtoc,2014,9(3):694-710.
[8] KÖNIGSBERG R,OBERMAYR E,BISES G,etal.Detection Of EPCAM positive and negative circulating tumor cells in metastatic breast cancer patients[J].ActaOncol,2011,50(5):700-710.
[9] CEGAN M,KOLOSTOVA K,MATKOWSKI R,etal.Invitroculturing of viable circulating tumor cells of urinary bladder cancer [J]IntJClinExpPathol,2014,7(10):7164-7171.
[10] HOU HW,WARKIANI ME,KHOO BL,etal.Isolation and retrieval of circulating tumor cells using centrifugal forces [J].SciRep,2013,3:1259.
[11] YEO T,TAN SJ,LIM CL,etal.Microfluidic enrichment for the single cell analysis of circulating tumor cells [J].SciRep,2016,6:22076.
[12] HALO TL,MCMAHON KM,ANGELONI NL,etal.Nanoflares for the detection,isolation,and culture of live tumor cells from human blood [J].ProcNatlAcadSciUSA,2014,111(48):17104-17109.
[13] KAIFI JT,KUNKEL M,DAS A,etal.Circulating tumor cell isolation during resection of colorectal cancer lung and liver metastases:a prospective trial with different detection techniques [J].CancerBiolTher,2015,16(5):699-708.
[15] LAMOUILLE S,XU J,DERYNCK R.Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition[J].NatRevMolCellBiol,2014,15(3):178-196.
[16] NIETO MA.The ins and outs of the epithelial to mesenchymal transition in health and disease [J].AnnuRevCellDevBiol,2011,27:347-376.
[17] UHR JW,PANTEL K.Controversies in clinical cancer dormancy [J].ProcNatlAcadSciUSA,2011,108(30):12396-12400.
[18] LIU H,REN G,WANG T,etal.Aberrantly expressed FRA-1 by IL-6/STAT3 transactivation promotes colorectal cancer aggressiveness through epithelial-mesenchymal transition [J].Carcinogenesis,2015,36(4):459-468.
[19] MAIER HJ,SCHMIDT-STRASSBURGER U,HUBER MA,etal.NF-kappa B promotes epithelial-mesenchymal transition,migration and invasion of pancreatic carcinoma cells [J].CancerLett,2010,295(2):214-228.
[20] GU K,LI MM,SHEN J,etal.Interleukin-17-induced emt promotes lung cancer cell migration and invasion via NF-κB/ZEB1 signal pathway [J].AmJCancerRes,2015,5(3):1169-1179.
[21] CHANRION M,KUPERSTEIN I,BARRIRE C,etal.Concomitant notch activation and p53 deletion trigger epithelial-to-mesenchymal transition and metastasis in mouse gut [J].NatCommun,2014,5:5005.
[22] YANG X,LIU S,YAN Q.Roleof fucosyltransferase iv in epithelial-mesenchymal transition in breast cancer cells [J].CellDeathDis,2013,4:e735.
[23] SALNIKOV AV,LIU L,PLATEN M,Hypoxia induces emt in low and highly aggressive pancreatic tumor cells but only cells with cancer stem cell characteristics acquire pronounced migratory potential [J].PLoSOne,2012,7(9):e46391.
[24] ZHENG X,CARSTENS JL,KIM J,etal.Epithelial-to-mesenchymal transition is dispensable for metastasis but induces chemoresistance in pancreatic cancer [J].Nature,2015,527(7579):525-530.
[25] ZHENG S,LIU Y,JIAO Y,etal.Chemically modified heparins inhibit fibrinogen-bridged indirect adhesion between tumor cells and platelets [J].OncolLett,2012,3(2):497-502.
[26] WILLINGHAM SB,VOLKMER JP,GENTLES AJ,etal.The CD47-signal regulatory protein alpha (sirpa) interaction is a therapeutic target for human solid tumors [J].ProcNatlAcadSciUSA,2012,109(17):6662-6667.
[27] MARDANI M,TADBIR AA,KHADEMI B,etal.Decreased serum monocyte chemoattractant protein 1 in salivary gland tumor patients [J].AsianPacJCancerPrev,2016,17(7):3601-3604.
[28] ROCCA YS,ROBERTI MP,JULIA EP,etal.Phenotypic and functional dysregulated blood nk cells in colorectal cancer patients can be activated by cetuximab plus IL-2 or IL-15 [J].FrontImmunol,2016,7:413.
[29] VILLARES GJ,ZIGLER M,DOBROFF AS,etal.Protease activated receptor-1 inhibits the maspin tumor-suppressor gene to determine the melanoma metastatic phenotype [J].ProcNatlAcadSciUSA,2011,108(2):626-631.
[30] LI TT,LIU H,LI FP,etal.Evaluation of epithelial-mesenchymal transitioned circulating tumor cells inpatients with resectable gastric cancer:relevance to therapy response [J].WorldJGastroenterol,2015,21(47):13259-13267.
[31] CHEN JF,HO H,LICHTERMAN J,etal.Subclassification of prostate cancer circulating tumor cells by nuclear size reveals very small nuclear circulating tumor cells in patients with visceral metastases [J].Cancer,2015,121(18):3240-3251.
[32] ROSTOKER R,ABELSON S,GENKIN I,etal.CD24(+) cells fuel rapid tumor growth and display high metastatic capacity [J].BreastCancerRes,2015,17:78.
[33] PAVESE JM,BERGAN RC.Circulating tumor cells exhibit a biologically aggressive cancer phenotype accompanied by selective resistance tochemotherapy[J].CancerLett,2014,352(2):179-186.
[34] PAILLER E,AUGER N,LINDSAY CR.High level of chromosomal instability in circulating tumor cells of ros1-rearranged non-small-cell lung cancer[J].AnnOncol,2015,26(7):1408-1415.
[35] NOMURA A,BANERJEE S,CHUGH R,etal.CD133 initiates tumors,induces epithelial-mesenchymal transition and increases metastasis in pancreatic cancer [J].Oncotarget,2015,6(10):8313-8322.
[36] GRILLET F,BAYET E,VILLERONCE O,etal.Circulating tumour cells from patients with colorectal cancer have cancer stem cell hallmarks inexvivoculture [J].Gut,2017,66(10):1802-1810.
[37] YU M,BARDIA A,ACETO N,etal.Cancer therapy.Exvivoculture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility [J].Science,2014,345(6193):216-220.
[38] CAYREFOURCQ L,MAZARD T,JOOSSES,etal.Establishment and characterization of a cell line from human circulating colon cancer cells [J].CancerRes,2015,75(5):892-901.
[39] GAO D,VELA I,SBONER A,etal.Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer [J].Cell,2014,159(1):176-187.
[40] ZHANG Z,SHIRATSUCHI H,LIN J,etal.Expansion of CTCs from early stage lung cancer patients using a microfluidic co-culture model [J].Oncotarget,2014,5(23):12383-12397.
[41] CHEN W,ZHENG R,BAADE PD,etal.Cancer statistics in China,2015 [J].CACancerJClin,2016,66(2):115-132.
[43] DUFFY MJ,STURGEON C,LAMERZ R,etal.Tumor markers in pancreatic cancer:a European Group on Tumor Markers (EGTM) Status Report[J].AnnOncol,2010,21(3):441-447.
[44] ALLARD WJ,MATERA J,MILLER MC,etal.Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases [J].ClinCancerRes,2004,10(20):6897-6904.
[45] GALL TM,FRAMPTON AE,KRELL J,etal.Is the detection of circulating tumor cells in locally advanced pancreatic cancer a useful prognostic marker? [J] .ExpertRevMolDiagn,2013,13(8):793-796 .
[46] KULEMANN B,PITMAN MB,LISS AS,etal.Circulating tumor cells found in patients with localized and advanced pancreatic cancer [J].Pancreas,2015,44(4):547-550.
[47] ZHANG Y,WANG F,NING N,etal.Patterns of circulating tumor cells identified by CEP8,CK and CD45 in pancreatic cancer [J].IntJCancer,2015,136(5):1228-1233.
[48] ZHOU JH,HU L,YU ZQ,etal.Marker expression in circulating cancer cells of pancreatic cancer patients [J].JSurgRes,2011,171(2):631-636.
[49] ANKENY JS,COURT CM,HOU S,etal.Circulating tumour cells as a biomarker for diagnosis and staging in pancreatic cancer [J].BrJCancer,2016,14,114(12):1367-1375.
[50] SHENG W,OGUNWOBI OO,CHEN T,etal.Capture,release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip [J].LabChip,2014,14(1):89-98.
[51] KHOJA L,BACKEN A,SLOANE R,etal.A pilot study to explore circulating tumor cells in pancreatic cancer as a novel biomarker [J].BrJCancer,2012,106(3):508-516.
[52] PORUK KE,VALERO V 3RD,SAUNDERS T,etal.Circulating tumor cell phenotype predicts recurrence and survival in pancreatic adenocarcinoma[J].AnnSurg,2016,264(6):1073-1081.
[53] DOTAN E,ALPAUGH K,RUTH K,etal.Prognostic significance of MUC-1 in circulating tumor cells in patients with metastatic pancreatic adenocarcinoma [J].Pancreas,2016,45(8):1131-1135.
[54] COURT CM,ANKENY JS,SHO S,etal.Reality of single circulating tumor cell sequencing for molecular diagnostics in pancreatic cancer [J].JMolDiagn,2016,18(5):688-696.
[55] SERGEANT G,VAN EIJSDEN R,ROSKAMS T,etal.Pancreatic cancer circulating tumour cells express a cell motility gene signature that predicts survival after surgery [J].BMCCancer,2012,12:527.
