循环游离DNA在胰腺癌中的临床应用进展

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(1复旦大学附属中山医院放射科 上海 200032; 2上海市影像医学研究所 上海 200032;3复旦大学附属中山医院介入治疗科 上海 200032)

循环游离DNA(circulating free DNA,cfDNA)是指存在于细胞外的血浆、血清以及其他体液中的核酸片段,1948年,Mandel等[1]首次在外周血中发现cfDNA的存在。健康人群cfDNA含量维持较低水平,而在炎症、创伤等状态下cfDNA的含量明显较健康人群高[2-3]。1977年,Leon等[4]发现,肿瘤患者的cfDNA水平明显高于健康人群;而与非转移性肿瘤对比,转移性肿瘤患者具有更高的cfDNA水平。但直到1994年,人们才发现这种携带了突变信息的cfDNA是肿瘤的标志,cfDNA的研究才与肿瘤关联起来[5]。

利用血液样本检测以及量化肿瘤突变的方法可被视为“液体活检”,在肿瘤的早期诊断、预后评估、复发转移监测中拥有巨大的潜力[6-7]。本文就游离DNA的来源、检测方法以及其在胰腺癌中的临床应用进行综述。

游离DNA的来源及特点游离DNA是游离于细胞外血液及体液中的脱氧核糖核酸片段。尽管其内源性已经被绝大多数学者接受,但其来源及释放机制仍不清楚[8-9]。目前认为游离DNA主要来源于凋亡细胞,除此之外,正常的活细胞也可以主动释放DNA片段。最近研究表明,游离DNA上的核小体可以用来追踪游离DNA片段的起源[10]。肿瘤游离DNA片段主要来源于凋亡以及坏死的肿瘤细胞、循环肿瘤细胞(circulation tumor cells,CTCs)以及肿瘤细胞分泌的外排体[11]。肿瘤患者cfDNA中包含了肿瘤和正常细胞来源的DNA片段,其中来源于肿瘤的cfDNA称为循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA),可以反映肿瘤组织的DNA特征[12]。通常来源于细胞坏死的DNA片段较来源于细胞凋亡的片段更大。这一特点被用来评估cfDNA中肿瘤来源的比例[13]。cfDNA在外周血中很快被清除,其半衰期从15 min到几个小时,这使得cfDNA成为一个实时的标志物[9]。肿瘤细胞从原发病灶脱落,进入血液循环形成CTCs。最初的研究认为ctDNA是来自于CTCs,而在不能检测到CTCs的患者中仍然可以检测到ctDNA[14-15]。因此,ctDNA与CTCs是不同的。

cfDNA和ctDNA的检测目前尚无标准的cfDNA提取方法,利用血浆还是血清、样本采集中使用不同的抗凝剂,冷冻保存的时间差异等均会影响cfDNA的浓度[8,16]。利用血浆或血清都可以提取cfDNA,血清中cfDNA浓度较高的原因是血液凝结过程中白细胞破裂释放了大量cfDNA,而这也使得肿瘤相关游离DNA的提取更加困难[17]。因此虽然血浆中DNA的水平低于血清,但利用血浆提取的DNA是研究肿瘤DNA的更好选择[18]。cfDNA的浓度也随着血浆或血清的保存时间延长而增加[19],这也对样品的保存时间提出了要求,保存时间的不一致可能导致检测结果的偏差。El等[16]研究分析前不同因素对cfDNA的影响并提出标准提取方法及纯化步骤[16]。

cfDNA的检测可分为定量和定性两大类。由于巨噬细胞的清除作用,健康人群cfDNA含量维持较低水平[20]。而肿瘤患者由于肿瘤细胞坏死、播散所释放的DNA超过了巨噬细胞的清除能力,因此cfDNA水平增高。而淋巴结转移和/或远处转移患者的游离DNA水平更高,这也提示cfDNA水平与肿瘤负荷相关[21]。游离DNA定性检测主要包括肿瘤特异性DNA的突变、重排以及甲基化。既往痕量的ctDNA水平限制了肿瘤特异性基因改变的检测。而高度敏感和特异性的方法已经被用来检测ctDNA,主要包括检测单核苷酸突变的BEAMing技术、微滴式数字PCR(droplet digital PCR)技术、标记扩增测序(tagged amplication deep sequencing,Tam-Seq)技术和安全测序系统(secure sequencing system,Safe-SeqS),以及评估拷贝数变异的全基因组测序[22-25]。不同技术的优势及局限性也被广泛讨论[26-27]。总的来说,靶向方法较非靶向方法具有更高的灵敏度[27]。最近研究表明,超灵敏技术可以在“海量”cfDNA中检测到最小量的ctDNA,在肿瘤的早期诊断或微小残留灶检测中发挥巨大的作用[28]。

cfDNA在胰腺癌中的临床应用胰腺癌起病隐匿、进展迅速,早期诊断困难,多数患者确诊时已属晚期,手术切除率仅为10%～20%[29-30]。化疗是改善中晚期胰腺癌患者预后的主要手段。胰腺癌患者的预后主要依赖于影像学分期、组织学分级及CA19-9水平[4-5,31]。在过去数十年中,胰腺癌的生存率并没有明显的改善[29]。寻找胰腺癌特异性的肿瘤标记物是早期诊断和改善预后的关键。cfDNA的定量和定性分析,可被视为一种“液体活检”,具有无创、无损、实时、多次的优点,在肿瘤早期诊断、监测、预后判断及个体化治疗方面具有广泛的前景。目前,胰腺癌cfDNA的检测分析已展现出一定的临床应用价值。

cfDNA定量检测在胰腺癌中的价值 肿瘤细胞坏死释放大量的DNA片段,因此肿瘤患者cfDNA水平明显高于健康人群。研究显示,健康人群血浆cfDNA水平为0～100 ng/mL,平均30 ng/mL,而肿瘤患者为0～1 000 ng/mL,平均180 ng/mL[32]。相关文献报道,胰腺癌患者cfDNA水平为71.2 (15.0～240.0)ng/mL,而健康人为34.6(22.2～48.4)ng/mL,差异有统计学意义(P=0.034)。进一步研究显示,胰腺癌cfDNA的浓度与肿瘤的血管侵犯和转移显著相关(P=0.001、P=0.030),而与肿瘤的大小、淋巴结转移和可切除性无关[33]。在胰腺癌与其他胰腺疾病的鉴别诊断方面,Sikora等[34]利用实时定量PCR的方法测定了50例胰腺导管腺癌、23例胰腺神经内分泌肿瘤、20例慢性胰腺炎及23例健康志愿者的血浆cfDNA水平及完整性。结果显示,胰腺导管腺癌患者cfDNA含量最高,与胰腺神经内分泌肿瘤、慢性胰腺炎及健康志愿者相比,差异具有显著统计学意义(P<0.001)。Berger等[35]对24例胰腺导管腺癌、21例胰腺导管内乳头状黏液瘤(intraductal papillary mucinous neoplasms,IPMN)及38例健康志愿者的cfDNA水平进行检测。发现与IPMN及健康志愿者相比,胰腺导管腺癌的cfDNA水平最高,差异具有显著统计学意义(P<0.001)。分析上述研究发现cfDNA水平并不一致,提取和检测方法的不同是导致结果差异的主要原因。cfDNA的检测流程标准化将为其临床应用奠定基础。

cfDNA定性检测在胰腺癌中的价值 肿瘤的发生是体细胞中多种基因改变和累积的结果。胰腺癌的发生与癌基因Kras,抑癌基因TP53、CDKN2A/p16及SMAD4的突变密切相关,超过90%的胰腺癌患者存在Kras基因突变[36-38]。因此患者的游离DNA中应该检测到这些来源于肿瘤的突变。大量的研究结果表明胰腺癌患者的游离DNA中含有Kras突变[39-46],并且证明Kras基因突变可以用来监测胰腺癌的发展。Dabritz等[43]对56例胰腺导管腺癌及13例胰腺炎患者的cfDNA中Kras基因突变进行检测,发现其中20例胰腺导管腺癌中检测到Kras突变,而在胰腺炎患者中均未检测到Kras突变。而另外2项研究在13%(4/31)[42]和5%(2/37)[46]的慢性胰腺炎患者血浆中检测到Kras突变,这些患者经外科手术切除病变部位,术后病理均未检测到胰腺癌,且在术后36个月的随访中,亦无检测到Kras突变的慢性胰腺炎患者发展成为胰腺癌。短暂检测出的Kras基因突变可能来源于增生的慢性炎性胰腺黏液细胞[47]。单独检测血浆Kras突变并不能作为诊断胰腺癌的可靠标志物,而与其他血清标志物联合检测,诊断敏感性显著提高。有研究报道联合检测Kras突变和CA199对胰腺癌的诊断敏感性达91%[43]。

有研究将胰腺癌肿瘤大小与cfDNA中Kras突变对比,结果发现两者之间无明显相关性[46]。而另外一组研究则发现Kras基因突变和肿瘤大小具有相关性[41]。cfDNA中Kras基因突变还可以作为判断胰腺癌预后的标志物。Castells等[45]和Chen等[46]研究发现,cfDNA中Kras基因突变与胰腺癌的分级、转移和生存率有关。Uemura等[44]在25例Ⅲ期胰腺癌外周血中检测到5例Kras基因突变,而37例Ⅳ期胰腺癌中有25例检测到Kras基因突变,这30例患者的生存期为6.3个月,明显低于外周血中未检测到Kras基因突变的患者(P<0.001)。而Singh等[33]研究发现胰腺癌cfDNA中Kras基因突变与肿瘤的大小、血管侵犯、淋巴结转移等病理因素无显著相关性,也与患者的总体生存率无关。cfDNA还可以作为胰腺癌外科手术后监测肿瘤残余、复发的重要指标。Uemura等[47]发现9例胰腺癌患者中有5例在外科术后外周血中未检测到Kras基因突变。Yamada等[41]研究了15例经外科手术和/或化疗的胰腺癌患者,其中12例外周血中Kras基因突变消失。

甲基化状态异常也被认为与肿瘤的发生密切相关。目前已有多种基因被证实为胰腺癌的甲基化标志物[48]。Melnikov等[49]研究发现外周血中CCND2、SOCS1、THBS1、PLAU和VHL这5个甲基化基因的联合检测有助于胰腺癌的诊断,其敏感性为76%,特异性为59%。Liggett等[50]研究胰腺癌、慢性胰腺炎及健康志愿者各30例,鉴定出辅助鉴别诊断的17个甲基化基因,其中8个可鉴别正常志愿者和慢性胰腺癌(敏感性81.7%,特异性78%),14个可鉴别慢性胰腺炎和胰腺癌(敏感性91.2%,特异性90.8%)。Park等[51]对16例胰腺癌、13例慢性胰腺炎及29例健康志愿者cfDNA的UCHL1、NPTX2、SARP2、ppENK、p16和RASSF1A共6个甲基化基因进行检测,结果发现81.3% (13/16)的胰腺癌、61.5% (8/13)的慢性胰腺炎及3.5% (1/29)健康志愿者中可以检测到这些甲基化基因,其中p16基因的甲基化在胰腺癌和慢性胰腺炎的鉴别诊断中更加敏感。该研究还表明甲基化与吸烟史、肿瘤大小及分期无关。cfDNA甲基化状态的检测对胰腺癌的诊断和鉴别诊断具有一定的临床应用价值。

微卫星(microsatellite,MS)又称短串联重复序列,是一类广泛存在于人类基因组的重复序列,一般为2～6个碱基。MS的改变包括不稳定性和杂合性缺失,与肿瘤的发生密切相关。MS不稳定性是肿瘤细胞特有的由于复制错误引起的遗传性改变。杂合性缺失是杂合的等位基因变成纯合性状态,从而导致抑癌基因的失活。1993年,Han等[52]发现胰腺癌组织的癌细胞中存在MS DNA不稳定性。针对胰腺癌的MS DNA检测发现,在cfDNA中检测MS不稳定性及等位基因失衡可能用于胰腺癌的诊断[53]。

cfDNA和CTCs的临床应用对比 与cfDNA相似,CTCs同样具有广泛的临床应用前景。2004年,美国FDA批准CellSearch系统用于转移性乳腺癌、前列腺癌和结直肠癌的外周血CTCs检测。转移性乳腺癌中外周血CTCs≥5个/7.5 mL提示预后较差[45]。胰腺癌相关研究显示外周血CTCs水平可以作为胰腺癌患者的生存预测指标,但仍不是胰腺癌可靠的标志物[54]。CTCs还可以用于胰腺癌化疗疗效监测以及个体化治疗方案的选择。

与ctDNA相比,CTCs提供完整的细胞,理论上可以基于DNA、RNA及蛋白质进行检测,从而更充分地了解肿瘤的发生发展过程。而外周血中CTCs含量低,检测困难。应用CellSearch系统,仅在20%的胰腺癌患者中检测到CTCs[54-56]。门静脉是胰腺癌CTCs血源性传播的主要途径。Catenacci等[57]对18例中晚期胰腺癌门脉及外周血CTCs进行比较,结果显示门脉血CTCs为(118.4±36.8)个/7.5mL,而外周血仅为(0.8±0.4)个/7.5 mL。尽管利用单个CTCs可以研究肿瘤分子特征,但由于肿瘤内部时空异质性,多项研究表明CTCs与组织以及CTCs之间有很大差异,结果的稳定性受到影响[58]。鉴于以上问题,ctDNA似乎能更好地了解肿瘤的突变。而随着分子技术的不断改进,两者互补能提供更多的临床信息。

结语随着检测技术的不断进步及转化医学的迅速发展,cfDNA在胰腺癌诊疗过程中的作用日益受到重视。cfDNA因其检测具有无创、无损、实时、可多次取材等优势而成为“液体活检”的理想工具。发展快速、精准、低成本的cfDNA检测技术以及进一步寻找特异性的胰腺癌ctDNA标志物,必将为胰腺癌患者的早期诊断及治疗提供积极的帮助。

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