MALDI-TOF MS与16SrDNA方法对肠杆菌科微生物鉴定比较分析

魏　超，代晓航，郭灵安，刘　炜，赵　欢

(1.四川省农科院分析测试中心，四川 成都　610066；2.华西师范大学生命科学院，四川 南充　637009)

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)是一种软电离新型有机质谱技术，是检测和鉴定多肽、蛋白质的强有力工具[1]，已被用于微生物检测。微生物核糖体蛋白和外周蛋白具有特异性，其主要为遗传因素控制，受培养环境、培养基成分等外部因素影响较小。MALDI-TOF MS具有灵敏度高、准确度高和样品处理速度快等特点，其通过基质辅助电离微生物蛋白质测得蛋白质和多肽的分子质量，形成独特的蛋白质片段组指纹图，通过特征性模式峰积累计算实现对微生物的鉴定[2-5]。

农产品表面微生物菌落构成复杂，即食类果蔬表面致病微生物易引起大规模卫生事件，在美国与欧盟的食品风险评估中为主要研究对象[6]。由于农产品的生产处理过程长期暴露在一定的空间环境，表面易感染肠杆菌科微生物，其部分菌属常引起人类腹泻和肠道感染，如沙门氏菌属、志贺氏菌属等，还有部分菌属会在一定条件下引起机会感染为条件致病菌[7]。

本实验拟采用MALDI-TOF MS和16SrDNA方法对农产品表面肠杆菌进行鉴定和归类，并研究这2种方法的归类学比较，旨在为高效、快速的农产品微生物鉴定提供理论支持。

1　实验部分

1.1　仪器

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪：日本岛津公司产品；PCR扩增仪：美国SimpliAmp公司产品；微生物自动鉴定仪：法国梅里埃公司产品；高压灭菌锅：上海三申公司产品；HF-safe-1200生物安全柜：上海立申公司产品。

1.2　试剂

DNA提取试剂盒：日本Takara公司产品；正向引物(F27) 5-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3，反向引物(R1492)5-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3的引物合成及测序：成都擎科公司产品；乙腈、乙醇：均为色谱纯，美国Fisher Scientific公司产品；甲酸(色谱纯)：美国Tedia公司产品；氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)：美国Sigma公司产品；实验用水为ddH2O。

1.3　样品及来源

10株微生物来源于金桔表面，符合肠杆菌科微生物特征并得到生化水平鉴定。分离方法为采用肠杆菌科显色培养基和伊红美蓝(EMB)对金桔表面微生物进行盲筛，采用营养琼脂纯化分离单菌落，对第二代纯化单菌落进行MALDI-TOF MS分析及16SrDNA测序。

1.4　MALDI-TOF MS对肠杆菌的鉴定及相关性分析

1.4.1样品前处理取菌适量，加入0.75 mL乙醇-水溶液(75∶25，V/V)，振荡1 min，离心去上清液；加入0.75 mL 70%乙酸水溶液振荡1 min，再加入0.75 mL乙腈振荡均匀，离心1 min；取1 μL点至靶板，加入1 μL CHCA基质(10 g/L，溶剂为乙腈-水溶液(1∶1，V/V))，晾干。

1.4.2质谱条件线性模式 mode liner SARAMIS；能量75 Hz；收集质荷比m/z2 000～20 000；样品扫描方式：Regular Circular，直径1 000.00 μm，间距100.00 μm，每样品叠加200个收集峰。

1.4.3微生物鉴定及相关分析将质谱图谱导入MYLA数据库与标准菌株的谱图进行多重比较，通过比对质荷比与标识峰得到微生物鉴定相关结果，根据收集微生物蛋白质图谱的质荷比和峰面积进行微生物之间的相关性分析，获得系统发育图谱。

1.5　16SrDNA鉴定及相关性分析

1.5.116SrDNA PCR反应体系25 μL PCR反应体系中，包含12.5 μL MasterMix(Taq酶、dNTP混合物、MgCl2以及反应缓冲液)，各1 μL 27f和1492r引物、1 μL模板 DNA、9.5 μL ddH2O。

1.5.216SrDNA PCR反应条件95 ℃预变性 5 min；PCRK扩增程序94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共进行35个循环；72 ℃延伸 7 min。

1.5.3微生物鉴定及相关性分析将PCR产物进行双向测序并拼接，测序结果提交NCBI blast比对，选取最高得分值获取鉴定相关结

果。将微生物16SrDNA序列在PRIMER PREMIER软件上整理，采用MAGA6.0软件邻接法(neighbor-joining)进行序列分析，构建发育树。

2　结果与讨论

2.1　MALDI-TOF MS与16SrDNA对10株肠杆菌科微生物鉴定比较

微生物MALDI-TOF MS鉴定结果列于表1，质谱图示于图1。MALDI-TOF MS对微生物鉴定为蛋白水平，对微生物的质谱前处理目的为促进微生物细胞破碎，蛋白质物质析出，同时样品中含有糖类和脂类，分子质量低于2 000的谱峰多为杂质峰且很难识别，所以选取分子质量在2 000～20 000的收集峰进行识别。微生物16SrDNA鉴定结果列于表2。两种方法与微生物生化法的鉴定结果属级一致，生化法对部分微生物只能鉴定到属级别，MALDI-TOF MS与16SrDNA均可将微生物鉴定到种级。MALDI-TOF MS与16SrDNA在微生物属级鉴定结果相同，但种级鉴定结果有2个偏差，表现在MALDI-TOF MS对3株微生物均鉴定为肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)，16SrDNA鉴定结果分别为肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌(Klebsiellaoxytoca)和克雷伯菌(Klebsiellasp.)。

表1　微生物MALDI-TOF MS鉴定结果Table 1　Identification results of microorganism by MALDI-TOF MS

注：a.11220001 1B4；b.11220003 1C1；c.11220003 1C3；d. y32016 1H3；e.y32016 1I2；f.dy2016111J1；g.dy2016111J3；h.y201611 1L1；i.dy201611 1L4；j.2A1；k.大肠杆菌ATCC 8739图1　MALDI-TOF MS微生物图谱 Fig.1　Microorganism mass spectra of MALDI-TOF MS

编号No.置信率Identification/%鉴定结果Identificationresults中文名称Chinesenames种Species属GenusGENEBANK最似标本号dy2016111L499肺炎克雷伯菌pneumoniaeKlebsiellaKU254764.1dy2016111J1100产酸克雷伯菌oxytocaKlebsiellaCP009274.2dy2016111J3100大肠埃希氏菌coliEscherichiaCP019008.1y2016111L1100产酸克雷伯菌sp.KlebsiellaKF761520.1y320161H399生癌肠杆菌cancerogenusEnterobacterNR118449.7y320161I299阪崎肠杆菌sakazakiiCronobacterNR044977.1112200031C199阴沟肠杆菌cloacaeEnterobacterCP011650.1112200031C399分散泛菌dispersaPantoeaHQ706112.1112200011B499日沟维肠杆菌gergoviaeEnterobacterKX981861.12A199粘质沙雷菌marcescensSerratiaNC019344.1

随着微生物研究不同生物技术方法的发展与应用，肠杆菌科微生物的分类位置一直在变化[7]，微生物蛋白质合成受基因水平控制，16SrDNA为控制核糖体蛋白生成的一段保守序列，可作为微生物区别手段；而MALDI-TOF MS鉴定是基于微生物整体蛋白质水平，选取重要特征标识峰进行识别。2种方法选择的数据源有一定联系，但鉴定所需数据来自2个不同的方向。2种方法对金桔分离的肠杆菌科微生物均获得了有效的鉴定结果，虽然2株克雷伯菌种级有偏差，但其余8株微生物属级、种级均一致。

2.2　MALDI-TOF MS与16SrDNA微生物相关分析比较

对MALDI-TOF MS测得的微生物标识峰质荷比及峰面积进行了相关分析，建立的树状图(相对相差<0.08%)示于图2。图2直观地反映了分离的10种微生物在蛋白质水平的相关性和亲缘位置，其中3株克雷伯菌的亲缘位置最近；日沟维菌和大肠埃希氏菌归于1个分支；阴沟肠杆菌和生癌肠杆菌对于1个分支亲缘关系较接近；但粘质沙雷菌和其余肠杆菌在2个大分支下显示亲缘关系较远。16SrDNA邻近连接方法系统发育归类示于图3。图3反

映了分离肠杆菌在16SrDNA水平下的亲缘关系与位置，其中，克雷伯属3株菌相对偏差较小，归于1个分支；生癌肠杆菌和阴沟肠杆菌有0.002差异，归于1个分支；阪崎肠杆菌和分散泛菌归于1个分支；粘质沙雷菌与其余肠杆菌差异较大，与其他肠杆菌分为2个分支。MALDI-TOF MS基于微生物蛋白质基质解析电离后，收集峰面积与保留时间进行相关计算，其计算方法与16SrDNA邻近连接方法基本一致，所给谱图均为无根树。2种归类方法对克雷伯菌(Klebsiella)的3株微生物的归类方向相同，且都认定生癌肠杆菌和阴沟肠杆菌的相似度较高，并归于1个分支。总体来看，在2种

计算方法下，金桔表面分离的肠杆菌科微生物的归类树状图谱差异较大，不同属微生物的分支地位及下级分支均不同。可见，对于微生物的相关分析，2种方法的差异较大。

16SrDNA是一段含有1 542个碱基的保守序列，该序列编码核糖体RNA的一个亚基，结构示于图4[8]。16SrDNA是细菌的系统分类研究中最有用、最常用的分子钟，其种类少，含量大(约占细菌RNA含量的80%)，分子大小适中，存在于所有生物中，其进化具有良好的时钟性质[9]，是普遍认可的微生物归类学手段。实验证明，虽然微生物外周蛋白和核糖体蛋白特异性受其基因组，乃至整个基因组调控，但MALDI-TOF MS对微生物蛋白质峰的收集是在基质解析的程度[10]，对收集标识峰计算相对数据容量较小，比16SrDNA测序方法信息量低，这可能是二者在做归类学分析时产生差异的原因之一。

图3　16SrDNA方法系统发育树图Fig.3　Dendrogram of 16SrDNA

图4　16SrDNA结构图Fig.4　Structure diagram of 16SrDNA

3　结论

16SrDNA对微生物的鉴定是学科内通用方法，相对认可度较高。MALDI-TOF MS是较先进的微生物鉴定方法，其原理基于微生物外周蛋白和核糖体蛋白的保守性，对微生物鉴定结果的准确度较高，分辨率在种属级，可作为一般条件下微生物鉴定的高效准确方法，但蛋白质标识峰归类法与普遍认可的基因学方法在肠杆菌科微生物归类中差异较大，为提高MALDI-TOF MS准确性，还需要进一步丰富微生物数据收集容量及优化相应算法。

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