槲皮素对宫颈癌细胞SiHa迁移和侵袭能力的影响

张 欣，董春力，陈嘉彦，高小翠，李少闻

(1.西安交通大学第二附属医院妇产科；2.手术麻醉科;3.儿科，陕西 西安 710004)

宫颈癌是一种常见的妇科恶性肿瘤，其发病率高居女性恶性肿瘤的第二位，是一种严重危害女性健康的恶性疾病[1]。在宫颈癌患者中，淋巴转移是宫颈癌患者不良预后的一个重要表现[2]，而且，肿瘤的侵袭和转移也是导致治疗失败以及引发宫颈癌患者死亡的一个重要原因[3]。槲皮素 (quercetin，Que)是一种广泛分布于植物的果实、叶子以及花中的中草药材，具有广泛的药理和生理作用，例如免疫调节、清除自由基、抗菌以及抗病毒等。越来越多的研究表明，槲皮素还具有抗肿瘤的生物学作用，槲皮素不仅可以抑制肿瘤细胞的增殖，还可以有效抑制多种肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。因此，本研究通过槲皮素处理人宫颈癌SiHa细胞,观察槲皮素对SiHa细胞迁移和侵袭能力的影响，并初步探讨其相关的作用机制，为槲皮素的临床应用提供一定的实验基础。

1材料与方法

1.1材料

人宫颈癌SiHa细胞株购自武汉普诺赛生命科技有限公司。槲皮素购于Sigma公司，DMEM培养基购于Gibco公司，胎牛血清购于四季青公司，基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinases-9， MMP9)鼠单克隆抗体和β-肌动蛋白(β-actin)鼠单克隆抗体均购于Santa Cruz公司，基质胶(Matrigel) 胶购于美国 Roche 公司；24 孔 Transwell 侵袭小室购于美国 Corning 公司，其余为国产分析纯试剂。

1.2方法

1.2.1细胞培养

人宫颈癌SiHa细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于含5%CO2的37℃孵箱中进行常规培养，每3～4天用胰酶消化，传代1次。

1.2.2槲皮素的配置与实验分组

将槲皮素溶解于二甲基亚砜(DMSO)中配置成储存母液，于-20°冰箱保存。在进行实验时，用DMEM培养基分别进行稀释，DMSO的最终浓度<0.1%。 对数生长期的人宫颈癌SiHa细胞分为对照组(DMEM培养基+DMSO，槲皮素浓度为0μmol/L)和实验组(槲皮素浓度分别为20、40和80μmol/L)。

1.2.3 Transwell体外迁移实验

SiHa细胞饥饿24h后制备成细胞悬液，离心后吸弃培养液，PBS清洗1遍后，将细胞用含有0.1% 胎牛血清的DMEM培养基进行重悬，调整细胞浓度为4×105。将200 μL的细胞悬液加入于Transwell上室，下室中加入600μL的含 10% 胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的DMEM培养基，之后置于含5%CO2的37℃孵箱中进行孵育。24h后,用棉签擦去上室内残留的细胞,甲醛固定10min后，用0.1%的结晶紫室温孵育10min，PBS清洗3遍后，将Transwell小室底面朝上于显微镜下拍照观察,随机选取5～10 个视野进行计数，进行统计分析，重复上述实验3次。

1.2.4 Transwell体外侵袭试验

SiHa细胞饥饿24h后制备成细胞悬液，离心后吸弃培养液，PBS清洗1遍后，将细胞用含有0.1% 胎牛血清的DMEM培养基进行重悬，调整细胞浓度为4×105。于Transwell上室中平铺1:3的Matrigel胶50μL，紫外灯照射消毒6h后，将200μL的细胞悬液加入于Transwell上室，下室中加入600μL的含 10% FBS 的DMEM培养基，之后置于含5%CO2的37℃孵箱中进行孵育。24h后,用棉签擦去上室内残留的细胞和Matrigel胶,甲醛固定10min后，用0.1%的结晶紫室温孵育10min，PBS清洗3遍后，将Transwell小室底面朝上于显微镜下拍照观察,随机选取5～10 个视野进行计数,进行统计分析，重复上述实验3次。

1.2.5 Western Blotting

将处于对数生长期的SiHa细胞通过胰酶消化后，接种于6孔细胞培养板中，待细胞贴壁后, 更换为含有不同浓度槲皮素的DMEM培养基(槲皮素浓度分别为0、20、40和80μmol/L)，继续培养48h后收集各组细胞，分别加入细胞裂解液收集细胞蛋白，并测定各组细胞的蛋白浓度。将蛋白样本与蛋白质分子量标准分别上样于加样孔，进行SDS-PAGE分离蛋白。电泳结束后，进行转膜，转膜结束后，将膜移至含5%的脱脂奶粉的TBST缓冲液中室温封闭1h，用TBST洗膜10min×4次 。加入一抗，4 ℃孵育过夜。次日，TBST洗膜10min×4次，加辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1h，TBST洗膜10min×4次,然后用化学发光检测液进行发光反应，于暗室中曝光。

1.3统计学方法

采用SPSS 12.0进行数据的统计学分析,实验数据结果均采用均数±标准差表示，多组样本间的均数比较采用单因素方差分析，两组样本间的均数比较采用t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1槲皮素抑制SiHa细胞体外迁移能力

为了研究槲皮素是否对人宫颈癌细胞SiHa的迁移能力具有影响，本研究首先通过使用Transwell小室，检测了不同浓度下槲皮素对SiHa细胞迁移能力的影响。结果显示，对照组中，每个视野下的细胞数为202.00±11.66，当槲皮素浓度分别为20、40和80μmol/L时，每个视野下的细胞数分别为148.80±14.01、46.00±15.36和13.80±3.96，同对照组相比均具有统计学意义(0μmol/L vs 20μmol/L：t=6.527，P=0.031；0μmol/L vs 40μmol/L：t=18.09，P=0.009；0μmol/L vs 80μmol/L：t=34.17，P=0.007，见图1。上述结果表明，槲皮素可以抑制SiHa细胞体外的迁移能力，而且随着槲皮素浓度的升高，这种抑制作用会进一步加强。

注：A为不同浓度槲皮素对SiHa细胞迁移的影响(结晶紫染色，40×)；B为槲皮素对SiHa细胞迁移的量化统计；*P<0.05，**P<0.01。

图1 Transwell小室检测槲皮素对SiHa细胞迁移能力的影响
Fig.1 The effect of quercetin on migration ability of SiHa cells detected by Transwell chamber

2.2槲皮素抑制SiHa细胞体外侵袭能力

此外，通过使用Transwell小室，进一步检测了不同浓度下槲皮素对SiHa细胞侵袭能力的影响。结果显示，对照组中，每个视野下的细胞数为138.00±13.40，当槲皮素浓度分别为20、40和80μmol/L时，每个视野下的细胞数分别为99.80±14.72、33.20±8.13和9.80±2.77，同对照组相比均具有统计学差异(0μmol/L vs 20μmol/L：t=4.291，P=0.029；0μmol/L vs 40μmol/L：t=14.95，P=0.0081；0μmol/L vs 80μmol/L：t=20.95，P=0.0074，见图2。上述结果表明，槲皮素可以抑制SiHa细胞体外的侵袭能力，而且随着槲皮素浓度的升高，这种抑制作用会进一步加强。

注：A为不同浓度槲皮素对SiHa细胞侵袭能力的影响(结晶紫染色，40×)；B为槲皮素对SiHa细胞侵袭的量化统计;*P<0.05，**P<0.01。

图2 Transwell小室检测槲皮素对SiHa细胞侵袭能力的影响
Fig.2 The effect of quercetin on invasion ability of SiHa cells detected by Transwell chamber

2.3 Western Blotting检测槲皮素对MMP9表达的影响

为了进一步探讨槲皮素影响SiHa细胞迁移和侵袭能力的作用机制，本研究通过Western Blotting方法检测了SiHa细胞中MMP9蛋白的表达。结果显示，同对照组相比，SiHa细胞在经过槲皮素处理后，MMP9蛋白的表达出现了明显的下调(0μmol/L vs 20 μmol/L：t=9.318，P=0.0029；0μmol/L vs 40μmol/L：t=10.21，P=0.002；0μmol/L vs 80μmol/L：t=14.81，P=0.0007，见图3。上述结果表明，槲皮素对SiHa细胞迁移和侵袭能力的抑制作用可能是通过下调MMP9蛋白的表达而实现的。

图3 Western Blotting检测槲皮素对SiHa细胞中MMP9蛋白表达的影响
Fig.3 The effect on MMP9 protein level in quercetin-treated SiHa cells detected by Western Blotting

3讨论

槲皮素是一种天然的黄酮类物质，广泛存在于植物的果实、花以及叶中，目前的研究表明，槲皮素不仅可以有效抑制前列腺癌、乳腺癌等肿瘤细胞的增殖，还可以抑制多种肿瘤的迁移能力和侵袭能力，例如在具有高转移特性的肝癌HCCLM6细胞中，槲皮素可以抑制其增殖和侵袭的能力[4]；在胶质瘤细胞U87中，槲皮素可以明显降低胶质瘤细胞的侵袭和迁移[5]；在结肠癌中，槲皮素不仅可以抑制结肠癌细胞的侵袭、运动和黏附，还可以抑制结肠癌细胞的增殖能力[6-7]；此外，槲皮素也可以抑制胃癌细胞BGC-803、口腔鳞状细胞癌SCC-15、卵巢癌HO8910PM等肿瘤细胞的迁移和侵袭[8]。

3.1槲皮素可以显著抑制SiHa细胞的迁移能力

Transwell小室迁移实验的结果显示，在对照组中，单个视野下的细胞数为202.00±11.66，而当槲皮素浓度为20μmol/L时，单个视野下的细胞数下降为148.80±14.01，当槲皮素浓度增加至40μmol/L时，单个视野下的细胞数下降为46.00±15.36，当槲皮素浓度增加至80μmol/L时，单个视野下的细胞数则下降为13.80±3.962，同对照组相比均具有统计学差异(均P<0.05)，上述结果表明，随着槲皮素作用浓度的增加，SiHa细胞的迁移能力出现了明显的下降，槲皮素可以显著抑制SiHa细胞的迁移能力。

3.2 槲皮素可以显著抑制SiHa细胞的侵袭能力

此外，通过Transwell小室侵袭实验进一步检测了槲皮素对SiHa细胞的侵袭能力的影响。在对照组中，单个视野下的细胞数为138.00±13.40，而当槲皮素浓度为20μmol/L时，单个视野下的细胞数为99.80±14.72，当槲皮素浓度增加至40μmol/L时，单个视野下的细胞数下降为33.20±8.13，当槲皮素浓度增加至80μmol/L时，单个视野下的细胞数则下降为9.80±2.77，同对照组相比均具有统计学差异(均P<0.05)，上述结果表明，槲皮素也可以抑制SiHa细胞的侵袭能力。

3.3 槲皮素通过下调MMP9蛋白的表达抑制SiHa细胞的迁移和侵袭能力

细胞基质金属蛋白酶(MMPs)是一组锌离子依赖性肽链内切酶, 主要由肿瘤周边的间质细胞以及肿瘤细胞所产生，不仅可以降解细胞外基质的大部分成分，还可以通过对细胞外基质的重塑从而促进肿瘤新生血管的生成, 最终促进肿瘤的侵袭和转移。李世正等于2013年的研究也表明，在乳腺癌MDA-MB-435S细胞中，槲皮素也可以通过下调MMP9蛋白的表达而抑制细胞的侵袭能力[9]。此外，在胃癌BGC-823细胞中，槲皮素通过下调MMP2蛋白的表达可以抑制胃癌BGC-823细胞的侵袭能力[10]。同样的，槲皮素通过下调MMP2和MMP9蛋白的表达，也可以抑制人结肠癌细胞的迁移和侵袭能力[6]。在本研究中，SiHa细胞在经过槲皮素处理后，随着槲皮素浓度的提高，可以显著抑制MMP9蛋白的表达。

综上所述，槲皮素可以抑制SiHa细胞的迁移和侵袭能力，而槲皮素对于SiHa细胞迁移和侵袭能力的抑制作用可能是通过下调MMP9蛋白在SiHa细胞中的表达而实现的。

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[专业责任编辑：张忠明]