鱼腥草活性成分槲皮素及其金属配合物的抗菌活性

徐海瑛， 郝红英， 陈青阁， 赵优琴， 李玉魁， 周小漫， 马 欣， 丁燕伟

(黄河科技学院医学院，河南郑州 450063)

鱼腥草(Houttuyniacordata)为三白草科蕺菜属植物，主要产于浙江、江苏、安徽、福建、河南等省，作为药食两用的植物，鱼腥草具有清热解毒、消痈排脓、利尿通淋等功能[1]。现代药理学研究表明，鱼腥草具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎症、抗肿瘤和提高免疫力等生理功效[2]。此外，鱼腥草含有多种活性物质成分，主要活性物质有挥发油和黄酮类化合物，如鱼腥草素、槲皮素、槲皮苷等[3]。槲皮素是植物界分布最广的黄酮类化合物，有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等多种生物活性[4-6]。由于槲皮素的水溶性较差，人们通常对槲皮素进行结构修饰。槲皮素对金属离子有很强的螯合作用，可以产生稳定的环状化合物，因此，近年来人们对槲皮素配合物的研究逐渐增多，成为开发利用槲皮素的新途径。

近年来，国内外研究者已经合成了30多种槲皮素金属配合物，有些金属配合物具有显著的抗氧化、抗炎、抗菌活性[7]。关于鱼腥草有效成分单体及其金属配合物对耐药菌株抗菌活性的研究较少。在提取鱼腥草中槲皮素及合成槲皮素金属配合物的试验基础上，本试验选择临床上常见的致病菌——金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，简称SA)和铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa，简称PA)的标准菌株和耐药菌株研究槲皮素单体及其金属配合物的抗菌活性，以期为开发槲皮素提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 药品 鱼腥草活性成分槲皮素单体，槲皮素-Zn(锌)、槲皮素-Mn(锰)、槲皮素-Cu(铜)、槲皮素-Fe(铁)、槲皮素-Mg(镁)等金属配合物，均由黄河科技学院化学实验室郝红英副教授所在课题组提供。

1.1.2 菌种 铜绿假单胞菌[美国模式培养物集存库(ATCC)保藏编号：ATCC27853]、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)由笔者所在实验室保存。铜绿假单胞菌耐药菌株、金黄色葡萄球菌耐药菌株由黄河科技学院医学院附属医院提供。

1.1.3 试剂与仪器 M-H(A)培养基(即水解酪蛋白琼脂培养基)、M-H(B)培养基(即水解酪蛋白肉汤培养基)、LB培养基，北京奥博星生物技术有限责任公司；2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)、二甲基亚砜(DMSO)，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。SW-CJ-1FD超净工作台，上海锦昱科学仪器有限公司；GH-500BC隔水恒温培养箱，北京市永光明医疗仪器有限公司；DRAGONLAB微量移液枪，深圳良谊实验室仪器有限公司。

1.2 方法

采用WHO(世界卫生组织)推荐的琼脂稀释法，通过测定最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，简称MIC)，评价槲皮素单体及其金属配合物的抗菌活性[8-10]。

1.2.1 药液制备 分别称取槲皮素单体及其金属配合物各100 mg，置于EP(eppendorf)管中，再加入二甲基亚砜(DMSO)2 mL，轻轻振摇，使得药物充分溶解，配制成浓度为 50 mg/mL 的原液，将原液分别用DMSO等倍稀释成浓度为25、12.5、6.25、3.125、1.562 5、0.781 25 mg/mL的药液。放入4 ℃冰箱中备用。

1.2.2 菌液制备 分别将SA和PA的标准菌株、耐药菌株接种在LB培养基上，于37 ℃温箱培养18～24 h。再将培养良好的上述细菌在无菌条件下接种至M-H肉汤培养基中，于37 ℃温箱培养4～6 h，将增菌后的菌液用生理盐水校正浓度至1.5×108CFU/mL，再用MH肉汤将菌悬液进行 1 ∶1 000 稀释后备用，含菌量约为105CFU/mL。

1.2.3 抑菌试验 配制M-H(A)培养基，并分装于试管中，将培养基进行高压蒸汽灭菌(121 ℃、20 min)，然后将培养基置于70 ℃恒温水浴箱中备用。在超净台中将M-H(A)培养基倒入无菌塑料培养皿中，加入已制备好的各浓度药液，充分混匀，静置凝固成含药平板，使药物的终浓度为5、2.5、1.25、0.63、0.31、0.17、0.08 mg/mL，DMSO的体积分数为10%。同时设空白对照和溶剂对照平板。每种浓度的药物和对照均设3次重复。在超净台中，取2 μL已制备好的菌液，点接种于含药平板上的相应位置，标记后置于37 ℃温箱内培养18 h。然后通过无菌操作在细菌接种点处加10 μL 0.5% 2，3，5-三苯基氯化四氮唑，置于37 ℃温箱中培养2～4 h后观察结果。

1.2.4 结果判定和处理 观察平板中细菌接种处的菌落颜色变化，细菌接种点显示红色，表示细菌生长，记录为“+”；细菌接种点不显示红色，表示细菌未生长，记录为“-”。细菌未生长时的最小药物浓度即为该药物对该细菌的最小抑菌浓度，计算重复试验MIC的平均值。数据以“平均值±标准差”表示，采用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理分析。

2 结果与分析

TTC是一种活菌染料，活细菌中的琥珀酸脱氢酶能将TTC还原成红色的甲瓒(Formazan)，从而使培养物呈现红色，而死细菌则为无色，因此细菌培养物显示红色表示有细菌生长，反之则表示无细菌生长。经试验测定，空白对照和DMSO溶剂对照中的4种菌株接种点处均显示红色，说明空白对照平板和溶剂对照平板上4种菌株生长良好，10% DMSO对4种菌株生长无任何影响，药物浓度是影响细菌生长的因素之一。MIC是细菌未生长时的最小药物浓度，MIC值越小，说明药物的抑菌作用越强。

2.1 对SA的抗菌活性

由表1、图1可以看出，对于SA标准菌株ATCC25923，槲皮素单体的MIC为1.88 mg/mL，槲皮素-Zn、槲皮素-Mn、槲皮素-Cu、槲皮素-Mg的MIC分别为0.31、3.75、5.00、5.00 mg/mL，而槲皮素-Fe的MIC大于 5.00 mg/mL。槲皮素-Zn的抑菌作用强于槲皮素单体(P<0.01)，而槲皮素-Mn(P<0.05)、槲皮素-Cu(P<0.01)、槲皮素-Mg(P<0.01)、槲皮素-Fe的抑菌活性弱于槲皮素单体。

表1 槲皮素及其金属配合物的最小抑菌浓度

注：“*”表示与槲皮素组相比差异显著(P<0.05)，“**”表示与槲皮素组相比差异极显著(P<0.01)。

由表1、图2可以看出，对于SA耐药菌株，槲皮素单体的MIC为0.94 mg/mL，槲皮素-Zn、槲皮素-Mn、槲皮素-Cu、槲皮素-Mg的MIC分别为0.94、3.75、3.75、5.00 mg/mL，而槲皮素-Fe的MIC大于5 mg/mL。槲皮素-Zn和槲皮素单体的抑菌作用相当，而槲皮素-Mn(P<0.01)、槲皮素-Cu(P<0.01)、槲皮素-Mg(P<0.01)、槲皮素-Fe的抑菌活性弱于槲皮素单体。

2.2 对PA的抗菌活性

对于PA标准菌株ATCC25893，槲皮素单体的MIC为 0.94 mg/mL，槲皮素-Zn、槲皮素-Mn、槲皮素-Cu、槲皮素-Mg、槲皮素-Fe的MIC分别为0.47、5.00、1.88、1.88、0.94 mg/mL。槲皮素-Zn的抑菌作用强于槲皮素单体(P<0.05)，槲皮素-Mn(P<0.01)、槲皮素-Cu(P<0.05)、槲皮素-Mg(P<0.05)的抑菌活性弱于槲皮素单体，槲皮素-Fe和槲皮素单体的抑菌活性相当(表1和图3)。

对于PA耐药菌株，槲皮素单体的MIC为 1.88 mg/mL，槲皮素-Zn、槲皮素-Mn、槲皮素-Cu、槲皮素-Mg、槲皮素-Fe的MIC分别为0.63、1.88、5.00、5.00、5.00 mg/mL。槲皮素-Zn的抑菌作用强于槲皮素单体(P<0.01)，槲皮素-Mn和槲皮素单体的抑菌活性相当，槲皮素-Cu(P<0.01)、槲皮素-Mg(P<0.01)、槲皮素-Fe(P<0.01)的抑菌活性弱于槲皮素单体(表1和图4)。

3 讨论与结论

SA为革兰氏阳性菌(G+)，是引起化脓性感染(如毛囊炎、肺炎、脓毒症、败血症等)的常见致病菌之一[11]。PA为革兰氏阴性菌(G-)，是引起医院感染的重要条件致病菌之一。近年来，随着抗生素的广泛应用，细菌的耐药性问题愈加突出，如耐药性SA、耐药性PA，这些耐药菌感染对人体健康都构成了极大威胁[12-13]。中草药因为具有不良反应小、资源丰富、价格低廉、作用靶位多、不易产生耐药性等特点而受到越来越多的关注。作为鱼腥草有效成分之一的槲皮素，具有多种生物活性，其作为金属离子螯合配体也一直倍受关注[7]。本试验研究了槲皮素单体及其5种金属配合物对SA和PA的质控菌株、耐药菌株的抗菌活性。

通过研究发现，槲皮素、槲皮素-Zn、槲皮素-Mn、槲皮素-Cu、槲皮素-Mg、槲皮素-Fe对SA、PA的标准菌株和耐药菌株均有抗菌活性。其中，槲皮素-Zn的抗菌活性强于槲皮素单体，而其他金属配合物的抗菌活性要弱于槲皮素。对于SA标准菌株，槲皮素-Zn的抗菌活性最强，其MIC为 0.31 mg/mL，其他抗菌活性强弱顺序为槲皮素、槲皮素-Mn、槲皮素-Cu、槲皮素-Mg、槲皮素-Fe；对于PA标准菌株，槲皮素-Zn的抗菌活性最强，其MIC为0.47 mg/mL，其他抗菌活性强弱顺序为槲皮素、槲皮素-Fe、槲皮素-Cu、槲皮素-Mg、槲皮素-Mn；对于SA耐药菌株，槲皮素-Zn和槲皮素抑菌活性相当，而其他金属配合物要弱于槲皮素；对于PA耐药菌株，槲皮素-Zn的抑菌活性要强于槲皮素，槲皮素-Mn和槲皮素的抑菌活性相当，其他金属配合物弱于槲皮素。本研究结果显示，槲皮素及其金属配合物可以抑制SA、PA的标准菌株和耐药菌株生长，从而为临床治疗耐药菌感染提供了试验基础，也为进一步开发利用槲皮素提供了理论依据。