红景天苷通过抑制氧化应激防治大鼠低氧性肺动脉高压*

黄菲菲，李耀浙，张　婷，王良兴，黄晓颖

(温州医科大学附属第一医院呼吸内科，温州市呼吸循环重点实验室，浙江 温州 325000)

低氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary arterial hypertension，HPH)是一种以血管阻力持续性升高和血管重塑为特征的进展性疾病。尽管HPH的确切机制仍不清楚，但已有研究表明，氧化应激与HPH的发生发展有着直接或间接的联系[1-2]。氧化应激是指机体由于缺乏抗氧化物质，如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和过氧化氢酶(catalase，CAT)等，和(或)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)产生过多，从而使抗氧化防御系统不足以清除ROS的一种状态。低氧暴露诱导生成的ROS攻击细胞膜上的脂质，催化花生四烯酸生成丙二醛(malondialdehyde，MDA)和8-异构前列腺素F2α(8-iso-prostaglandin F2α，8-iso-PGF2α)。MDA 和8-iso-PGF2α被认为是检测氧化应激状态和自由基介导的脂质过氧化的可靠的指标。正常机体内存在功能正常的SOD和CAT等酶类抗氧化系统，以及非酶类抗氧化系统维持机体内ROS的平衡，其中，SOD是清除体内ROS的关键酶，SOD1(Cu-ZnSOD)则是其主要类型，在细胞内主要表达于细胞质中。本研究通过检测HPH动物模型肺组织匀浆中NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 4，NOX4)和SOD1蛋白相对表达量及MDA和8-iso-PGF2α含量，以及血清中SOD活性、MDA、8-iso-PGF2α含量来检测低氧性肺动脉高压大鼠肺部及整体的氧化应激水平。

红景天又名高山红景天，红景天苷(salidroside，Sal)是其根部提取物中的一种单体成分，具有抗氧化的功效。本课题组前期研究发现，红景天苷能有效改善低氧诱导的大鼠肺动脉高压[3]。然而，氧化应激是否参与了红景天苷对大鼠HPH的调节机制目前尚不清楚。本研究利用低氧氧舱复制HPH大鼠模型，通过观察不同浓度红景天苷对HPH大鼠血流动力学、肺血管显微结构以及血清和肺组织氧化应激相关指标的影响，探讨红景天苷是否能通过抑制氧化应激改善大鼠低氧性肺动脉高压。

材　料　和　方　法

1　材料

红景天苷购自上海源叶生物科技有限公司，批号为C11M7Q14603，纯度≥98%，每瓶100 mg；MDA和SOD试剂盒购自南京建成生物工程研究所；8-iso-PGF2αELISA试剂盒购自上海博蕴生物有限公司；兔抗NOX4和SOD1多克隆抗体购自Abcam；兔抗GAPDH抗体购自Cell Signaling Technology；其余试剂均为市售分析纯试剂。

2　方法

2.1动物模型分组与低氧模型复制32只健康雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠由温州医科大学实验动物中心提供(动物合格证编号为SYXK(浙)2015-0009，购于上海斯莱克实验动物有限公司)，体重180～220 g，按照随机法分为4组，每组8只：常氧(normoxia，N)组作为对照组，饲养于常温常压下；低氧4周(hypoxia for 4 weeks，H4)组、红景天苷低剂量(hypoxia for 4 weeks and treatment with Sal at 16 mg/kg，H4S16)组和红景天苷高剂量(hypoxia for 4 weeks and treatment with Sal at 32 mg/kg，H4S32)组均置于常压低氧氧舱内，维持O2浓度(10±1)%，CO2浓度<5%，用适量无水氯化钙控制舱内水蒸气，每天8 h，每周6 d，持续4 周。其余时间与N组处于同一室内环境中(室温20～24 ℃、相对湿度 50%～55%)。每天入舱前半个小时H4S16和H4S32组分别通过腹腔注射红景天苷16 mg/kg和32 mg/kg，N和H4组腹腔注射等体积生理盐水。

2.2平均肺动脉压(mean pulmonary arterial pressure，mPAP)和右心肥厚指数[weight ratio of right ventricle/(left ventricle+septum)，RV/(LV+S)]的测定根据邹丽珍等[4]的方法，对大鼠进行mPAP的测量。造模完成后，称量并记录大鼠重量，用20%乌拉坦按照8 mL/kg的剂量对大鼠进行麻醉，麻醉完成后，将大鼠四肢固定于大鼠专用手术板上，分离大鼠右侧颈外静脉，自制聚乙烯(polyethylene，PE)导管通过压力传感器与PowerLab生理记录仪相连接，将PE管经颈外静脉缓慢插入大鼠右心室进入肺动脉，得到稳定的波形，记录为mPAP，退出导管并结扎血管。分离另一侧颈总动脉，采血置于4 ℃保存。迅速开胸，剪下心脏及肺组织，用磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline，PBS)洗去组织表面血液，剪除心房，用组织剪沿着室间隔将心脏分离成右心室(right ventricle，RV)及左心室和室间隔(left ventricle+septum，LV+S)，称量并记录，计算RV/(LV+S)比值。

2.3光镜标本制作及观察上述分离的肺组织经PBS洗去表面血液后，取右肺上叶组织，用4%多聚甲醛充分固定，并进行脱水透明、石蜡包埋以及切片(厚度约4 μm)，行HE染色。用显微镜观察肺细小动脉(直径 50～200 μm)的形态变化并拍照，用图像分析软件计算分析血管壁面积/血管总面积(vessel wall area/vessel total area，WA/TA)。

2.4血清和肺组织匀浆氧化应激相关指标的测量上述采取的血液通过离心机8 000 r/min离心5 min，分离得到大鼠血清，同时制备肺组织匀浆。采用羟胺法检测血清中SOD活性，硫代巴比妥酸比色法检测血清和肺组织匀浆中MDA含量，采用ELISA法检测血清和肺组织匀浆中8-iso-PGF2α含量，所有试剂盒均严格按照说明书进行操作。

2.5Western blot检测肺组织匀浆NOX4和SOD1蛋白的相对表达量称取相应肺组织提取总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度。取80 μg蛋白经SDS-PAGE、转膜后，蛋白转移至PVDF膜中，用5%脱脂奶粉封闭1 h，用兔抗大鼠NOX4和SOD1多克隆抗体(稀释为1∶1 000)，4 °C孵育过夜。第2天取出PVDF膜，PBS洗涤后 II 抗室温孵育1 h，洗膜后化学发光显影，用Image Lab凝胶图像分析软件分析灰度值。

3　统计学处理

采用SPSS 22.0统计软件分析结果。所有数据均采用均数±标准差(mean±SD)表示，并进行正态性检验。多组均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间均数比较采用SNK-q检验。相关性分析采用Pearson分析法。以P<0.05为差异有统计学意义。

结　　果

1　各组大鼠mPAP和RV/(LV+S)的比较

低氧组mPAP显著高于常氧组(P<0.05)，红景天苷低、高剂量组mPAP均显著低于低氧组(P<0.05)，红景天苷高剂量组mPAP低于红景天苷低剂量组(P<0.05)，见图1。低氧组大鼠RV/(LV+S)显著高于常氧组(P<0.05)，红景天苷低、高剂量组RV/(LV+S)均显著低于低氧组(P<0.05)，红景天苷高剂量组RV/(LV+S)低于红景天苷低剂量组(P<0.05)，见图2。

Figure 1.The effects of salidroside on the mPAP of the rats.The mPAP waves were recorded by PowerLab.Mean±SD.n=8.*P<0.05vsN group;#P<0.05vsH4group;△P<0.05vsH4S16 group.
图1各组大鼠肺动脉压波形图及数值变化

2　各组大鼠肺细小动脉显微结构的变化

低氧组肺细小动脉出现显著重构现象，光镜下可见低氧组大鼠肺细小动脉管壁明显增厚；红景天苷低、高剂量组肺细小动脉管壁增厚程度显著轻于低氧组；红景天苷高剂量组肺细小动脉管壁增厚程度轻于红景天苷低剂量组。低氧组肺细小动脉WA/TA比值显著高于常氧组(P<0.05)；红景天苷低、高剂量组WA/TA比值显著低于低氧组(P<0.05)；红景天苷高剂量组WA/TA比值显著低于红景天苷低剂量组(P<0.05)，见图3。

Figure 2.RV/(LV+S) was calculated in each group.Mean±SD.n=8.*P<0.05vsN group;#P<0.05vsH4group;△P<0.05vsH4S16 group.
图2各组大鼠右心室肥厚指数的比较

3　各组大鼠氧化系统相关指标的变化

低氧组肺组织匀浆NOX4相对表达量显著高于常氧组(P<0.05)，血清和肺组织匀浆MDA和8-Iso-PGF2α含量显著高于常氧组(P<0.05)；红景天苷低、高剂量组肺组织匀浆NOX4相对表达量显著低于低氧组(P<0.05)，血清和肺组织匀浆MDA和8-iso-PGF2α含量显著低于低氧组(P<0.05)；红景天苷高剂量组肺组织匀浆NOX4相对表达量低于红景天苷低剂量组(P<0.05)，血清和肺组织MDA和8-iso-PGF2α含量低于红景天苷低剂量组(P<0.05)，见图4、5。

Figure 3.The effects of salidroside on the pulmonary arterial remodeling (HE staining,×400).Mean±SD.n=8.*P<0.05vsN group;#P<0.05vsH4group;△P<0.05vsH4S16 group.
图3各组大鼠肺血管形态变化

4　各组大鼠抗氧化系统相关指标的变化

低氧组肺组织匀浆SOD1相对表达量显著低于常氧组(P<0.05)，血清SOD活性显著低于常氧组(P<0.05)；红景天苷低、高剂量组肺组织匀浆SOD1相对表达量显著高于低氧组(P<0.05)，血清SOD活性显著高于低氧组(P<0.05)；红景天苷高剂量组肺组织匀浆SOD1相对表达量高于红景天苷低剂量组(P<0.05)，血清SOD活性高于红景天苷低剂量组(P<0.05)，见图6。

Figure 4.The effects of salidroside on the expression of NOX4 in the rats with different treatments determined by Wes-tern blot.Mean±SD.n=8.*P<0.05vsN group;#P<0.05vsH4group;△P<0.05vsH4S16 group.
图4各组大鼠NOX4蛋白Westernblot检测结果

5　相关性分析

5.1氧化系统指标的相关性分析肺组织匀浆NOX4相对表达量与mPAP呈线性正相关(r=0.738，P<0.01)，肺组织匀浆NOX4相对表达量与肺组织匀浆MDA和8-iso-PGF2α含量呈线性正相关(r=0.729，r=0.709，均P<0.01)，见图7。

5.2抗氧化系统指标的相关性分析肺组织匀浆SOD1相对表达量与mPAP呈线性负相关(r=-0.708，P<0.01)，肺组织匀浆SOD1相对表达量与肺组织匀浆MDA和8-iso-PGF2α含量呈线性负相关(r=-0.740,r=-0.728，均P<0.01)，见图8。

讨　　论

由于ROS的产生和消除之间的不平衡导致的氧化应激损伤是引起人类慢性疾病的重要原因，包括心血管疾病、糖尿病、衰老和肿瘤等。因此，对于氧化应激的研究，不仅要在细胞水平，更要在整个生物体的背景下。

Figure 5.The effects of salidroside on the contents of MDA and 8-iso-PGF2αin the rats with different treatments.Mean±SD.n=8.*P<0.05vsN group;#P<0.05vsH4group;△P<0.05vsH4S16 group.
图5各组大鼠肺组织和血清MDA和8-Iso-PGF2α的检测结果

肺血管阻力升高和血管重塑是肺动脉高压的主要病理特征，本研究利用低氧氧舱复制慢性低氧肺动脉高压大鼠模型，结果显示，低氧组大鼠平均肺动脉压和右心指数显著升高，光镜下，肺细小动脉壁显著增厚，表明慢性低氧性肺动脉高压大鼠模型已经成功建立。

多项研究表明，过度的氧化应激在肺动脉高压的发生发展中扮演重要的角色[5-6]。NADPH氧化酶能够将电子从NADPH转移给氧分子，生成超氧阴离子，是机体中非线粒体ROS的主要来源。7种NADPH氧化酶同源物组成了NOX家族蛋白，包括NOX1～5以及DUOX1和DUOX2。这7种NADPH氧化酶同源物在肺组织不同的细胞中有不同的分布，Hoidal等[7]研究表明，NOX4是人类肺气道和肺血管平滑肌细胞中的主要亚型。此外，血管内皮细胞也表达NOX4[8]。低氧暴露能够引起肺血管中NOX4的表达上调，进而促进ROS的生成，ROS通过影响血管内皮细胞中相关因子的表达导致内皮细胞功能障碍，使得血管活性物质分泌异常，引起肺动脉平滑肌增殖[9-10]，导致肺血管重塑，引起肺动脉高压。

Figure 6.The effects of salidroside on the expression of SOD1 (A) and the serum content of SOD (B) in the rats with different treatments.Mean±SD.n=8.*P<0.05vsN group;#P<0.05vsH4group;△P<0.05vsH4S16 group.
图6各组大鼠肺组织SOD1蛋白表达量和血清SOD活性的变化

Figure 7.Correlation analysis of the indexes related to oxidative system.A:correlation analysis of NOX4 protein expression with the value of mPAP; B:correlation analysis of NOX4 protein expression with the content of MDA in the lung tissues; C:correlation analysis of NOX4 protein expression with the level of 8-iso-PGF2αin the lung tissues.
图7氧化系统相关指标的相关性分析

Figure 8.Correlation analysis of the indexes related to antioxidant system.A:correlation analysis of SOD1 protein expression with the value of mPAP; B:correlation analysis of SOD1 protein expression with the content of MDA in the lung tissues; C:correlation analysis of SOD1 protein expression with the level of 8-iso-PGF2αin the lung tissues.
图8抗氧化系统相关指标的相关性分析

红景天苷作为多年生草本植物红景天的中药单体，具有增强免疫力、保护心血管、抗辐射和抗氧化等多重功效，故又名“黄金根”。整体动物和细胞水平的实验均表明，红景天苷能够有效抑制肺动脉平滑肌增殖、肺血管重塑，改善肺动脉高压[3,11]。本实验研究结果显示，在低氧处理的同时连续给予红景天苷(16 mg/kg或32 mg/kg)4周后，低氧性肺动脉高压大鼠的肺动脉压力、肺血管重构及右心肥厚均显著改善，提示红景天苷对HPH大鼠确实具有减轻低氧诱导的肺血管重塑及肺动脉高压的作用。

有研究报道，红景天苷能减少心肌缺血大鼠心肌组织NOX4表达，降低心肌组织MDA值，提高SOD活力值，通过抑制氧化应激改善心肌缺血状况[12]。因此，我们推测红景天苷治疗大鼠HPH的作用可能也与氧化应激有关。本研究发现低氧肺动脉高压大鼠肺组织匀浆NOX4蛋白表达、肺组织匀浆和血清MDA和8-iso-PGF2α含量均显著升高，肺组织匀浆SOD1蛋白表达和血清SOD活性显著下降，表明低氧大鼠肺部及整体氧化/抗氧化系统失衡，氧化应激水平增强。而红景天苷能有效减轻上述改变，提示红景天苷有效降低了HPH大鼠的肺部和整体的氧化应激水平，并一定程度恢复了HPH大鼠的抗氧化能力。

此外，通过相关性分析还发现，肺组织匀浆NOX4蛋白表达与mPAP及肺组织匀浆MDA和8-iso-PGF2α含量呈线性正相关，肺组织匀浆SOD1蛋白表达与mPAP及肺组织匀浆MDA和8-iso-PGF2α含量呈线性负相关，且各相关性均良好。以上实验结果提示，红景天苷可能通过抑制肺组织NOX4表达并提高肺组织SOD1表达和增强血清SOD活性，这2种途径减轻低氧肺动脉高压大鼠氧化/抗氧化水平失衡，降低肺部和整体的氧化应激水平，从而起到保护肺动脉高压的作用。

总之，红景天苷可能通过减少低氧诱导的大鼠ROS产生和增强机体对ROS的清除能力，恢复氧化/抗氧化系统平衡，减轻低氧引起的肺组织过氧化应激损伤，缓解肺血管重构，抑制肺动脉高压。这为临床防治肺动脉高压提供了一条新的思路。

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