高浓度七氟醚通过抑制VEGF/PI3K/AKT信号通路诱导神经干细胞凋亡的研究

尹楠 严恩石 刘莉 孙强

随着宫内胎儿治疗技术的发展，麻醉药物对胎儿及新生儿中枢神经功能的影响也越来越引起更多的关注和研究。七氟醚作为临床常见的吸入麻醉药物，通常在2﹪的吸入浓度就可以达到维持孕期手术的最低浓度剂量，一旦吸入浓度超过3.5﹪就会对母体的血液循环产生影响，进而影响胎儿的血供和健康[1-2]。最近的研究发现：在大脑早期发育阶段接触麻醉药物会引起神经的退行性改变和学习能力的受损，进而出现神经发育损伤和婴儿出生后的认知功能障碍[3-4]。因此七氟醚作为临床中最为常见的吸入麻醉药物，也是孕期手术患者首选的麻醉维持药物，但是七氟醚对胚胎神经干细胞生长发育的研究却十分有限。

神经干细胞是一类具有高度的自我更新、增殖和多项分化潜能的细胞，因此中枢发育的窗口期神经干细胞的数量和功能状态会直接影响大脑的发育以及胎儿出生后的认知学习功能[5-6]。最新的研究也证实了体外培养的大鼠神经干细胞接受七氟醚的刺激后会影响其自我更新能力，但其潜在的分子机制尚不清楚[7-8]。

在本研究中，通过孕中期母鼠暴露于不同浓度七氟醚后，研究出生后小鼠的行为认知功能以及神经干细胞的凋亡情况，探索孕中期七氟醚暴露诱导神经干细胞发生凋亡的具体潜在分子机制。

材料与方法

一、实验动物及仪器

实验动物选择SPF级雌性孕14 d的SD大鼠，购自南京医科大学附属口腔医院实验动物中心，相关实验内容获得医院伦理委员会批准[CZEC（2017）-09]。MP150电生理记录仪（美国Biopac公司）；荧光显微镜（日本Nikon公司）。

二、方法

1.分组方式：实验前动物自由饮水摄食，自然光照明。以计算机生成随机数字的方法将所有孕中期大鼠随机分为3组，对照组，低浓度七氟醚组，高浓度七氟醚组，每组48只孕鼠。

2.建模方法：将14 d孕期的SD大鼠放入配有麻醉气体检测仪的麻醉箱内，高浓度组吸入七氟醚浓度为3.5﹪，持续2 h；低浓度组吸入七氟醚浓度为2﹪，持续2 h，吸入氧浓度均为30﹪，对照组大鼠吸入30﹪浓度的氧气，持续2 h。整个实验过程中大鼠始终保持自主呼吸，监测大鼠脉搏、血压、呼吸、心率，麻醉过程发生低血压时进行鼠尾静脉注射0.3 mg/kg的肾上腺素。麻醉结束后将所有孕鼠放回饲养环境待特定时间点取胎鼠或子代大鼠脑组织进行冰冻切片备用，时间点包括七氟醚吸入后6、24和 48 h，出生当天（P 0），出生后 14 d（P 14），出生后28 d（P 28），每个时间点设置8只孕鼠以备实验取材。

3.免疫印迹法检测胎鼠和新生小鼠海马组织中Nestin及脑组织中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），磷 脂 酰 肌 醇 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，pi3k），蛋 白 激 酶B（AKT）和p-AKT的蛋白含量：检测七氟醚麻醉后6 h胎鼠大脑组织中的VEGF，PI3K，p-AKT和AKT水平以及麻醉后6、24和48 h和出生后P 0、P 14、P 28幼鼠海马组织中Nestin的表达水平，每只母鼠取3只胎鼠作为重复。

每组称取0.1 g的组织样品，加入500 μl蛋白裂解液处理组织后采用组织匀浆机充分粉碎匀浆，4℃，8 000×g，离心10 min，保留上清液以BAC 蛋白定量每个样品的蛋白浓度，配平和煮样变性后，经SDS-PAGE凝胶电泳后转膜至PVDF膜上，5﹪脱脂牛奶封闭2 h，抗VEGF、抗PI3K、抗p-AKT和抗 AKT 抗体分别以 1:1 000，1:200，1:200，1:200和1:100稀释，并在4℃孵育过夜，以GAPDH作为内参。隔天弃掉一抗，以TBST洗膜3次，每次10 min，后室温孵育二抗2 h（1:10 000稀释），重复TBST洗膜3次后，以天能ECL显影系统进行曝光，采用Image-Pro Plus6.0软件测定条带的灰度值，以目标蛋白与GAPDH条带的灰度值之比表示目标蛋白的表达水平。

4.Nestin / TUNEL免疫荧光双标染色：选取麻醉后6、24和48 h以及在出生后P 0、P 14、P 28的胎鼠或幼鼠脑组织进行免疫荧光染色（n= 8只妊娠母鼠，每只母鼠取3只胎鼠作为重复），采用4﹪多聚甲醛进行组织固定后切成8 mm的冠状脑切片，每只大鼠使用3个脑切片，与10﹪牛血清白蛋白在37 ℃的培养箱中孵育30 min进行封闭，与抗Nestin抗体（1:100）于4 ℃冰箱孵育过夜。次日PBS冲洗3遍后，避光滴加兔抗鼠的二抗、TUNEL试剂（1:10）和 TRITC（1:50），37℃避光孵育 2 h，然后用 PBS洗涤3次，加入DAPI染色液孵育5 min后，用封固剂覆盖载玻片，荧光显微镜下读片。Nestin阳性为红色，代表神经干细胞特异性标志，鉴定为NSCs。DAPI阳性为蓝色，标记细胞核。TUNEL阳性为绿色，代表凋亡细胞。

5.细胞计数：在荧光显微镜上读取免疫荧光图像，并使用Image J软件进行图像分析，计数海马组织中神经干细胞和凋亡神经干细胞的数量，每只幼鼠以5个随机切片进行阳性细胞的定量分析。

三、统计学分析方法

采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，免疫荧光染色图像统计阳性着色细胞数量，免疫印迹图像进行灰度值扫描后行半定量分析数据以± s表示。对照、低剂量和高剂量3组间比较进行单因素方差分析，然后进行Bonferroni事后检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、妊娠中期七氟醚暴露对孕鼠生命体征的影响

记录七氟醚暴露过程中孕鼠的生命体征及低血压等不良事件的发生情况证实，高浓度和低浓度的七氟醚暴露均会增加孕鼠术中低血压事件的发生，其中对照组低血压事件0，低浓度七氟醚暴露组低血压事件2例，高浓度七氟醚暴露组低血压事件3例，均以鼠尾静脉注射0.3mg/kg的肾上腺素进行纠正后恢复，但是不同浓度七氟醚暴露组之间低血压事件的发生率差异无统计学意义。

二、妊娠中期七氟醚暴露对胎儿及新生儿海马组织中Nestin表达的影响

进行Nestin的免疫染色证实：与对照组相比，低浓度七氟醚组的Nestin阳性细胞在任何时间点差异均无统计学意义（P＞0.05）。相反，在全部的6个时间点，高浓度七氟醚组中Nestin阳性细胞的数量减少（P＜0.05，图 1、2，表 1）。Western Blot结果证实，高浓度七氟醚组Nestin蛋白水平在所有时间点均低于对照组（P＜0.05，图3）。这些结果均表明，妊娠中期高浓度的七氟醚暴露会抑制子代小鼠大脑中神经干细胞的发育。

图1 荧光显微镜下观察各组胎鼠大脑神经干细胞（Nestin染色，×400）

图2 荧光显微镜下观察出生后各组小鼠大脑神经干细胞（Nestin染色，×400）

表1 在不同时间点Nestin染色阳性细胞所占比例的定量分析（x± s）

图3 免疫印迹检测不同时间点大脑组织中Nestin蛋白的表达水平

三、妊娠中期七氟醚暴露对子代小鼠神经干细胞凋亡情况的影响

Nestin / TUNEL双标染色阳性被认为是发生凋亡的神经干细胞，从图4、5的免疫荧光染色可见，在七氟醚暴露后的所有时间点，低浓度七氟醚组合对照组之间发生凋亡的神经干细胞数量差异无统计学意义，但是高浓度七氟醚组小鼠在暴露后的6、24和48 h以及出生后的P 0、P 14发生凋亡的神经干细胞数量高于对照组（P＜ 0.05，表2）。表明妊娠中期暴露于高浓度七氟醚会诱导胚胎及新生小鼠大脑的神经干细胞发生凋亡。

四、妊娠中期七氟醚暴露对胎儿大脑中BAX，BAD，VEGF，PI3K，AKT和p-AKT蛋白水平的影响

Western Blot检测发现，高浓度七氟醚组VEGF，PI3K和p-AKT蛋白表达水平低于对照组，但是AKT总蛋白的表达在3组之间差异无统计学意义，与此同时PI3K-AKT信号通路下游的凋亡相关蛋白BAX和BAD在高浓度组的表达高于对照组和低浓度组，证实妊娠中期暴露于高浓度的七氟醚会降低VEGF，PI3K和p-AKT蛋白水平，抑制EGFR-PI3K-AKT信号通路并诱导凋亡信号通路的活化，促使神经干细胞发生早期凋亡。（图6）

讨 论

研究结果发现妊娠中期进行高浓度七氟醚的暴露会降低胎鼠及子代小鼠脑组织中VEGF，PI3K和p-AKT蛋白水平并诱导神经干细胞发生凋亡，从而对子代的神经干发育及认知功能产生负作用，但是对于妊娠期七氟醚暴露造成的中枢功能障碍发生的具体机制一直不清楚。有学者认为海马组织中神经干细胞数量的减少是子代动物发生认知功能障碍发生的基础[9-10]。

图4 荧光显微镜下观察各组妊娠中期七氟醚暴露后胎鼠大脑神经细胞（Nestin和TUNEL免疫荧光双标染色，×400）

图5 荧光显微镜下观察出生后各组七氟醚暴露后小鼠大脑神经细胞（Nestin和TUNEL免疫荧光双标染色，×400）

表2 不同时间点Nestin和TUNEL染色双阳性细胞定量分析（± s）

表2 不同时间点Nestin和TUNEL染色双阳性细胞定量分析（± s）

注：与对照组比较，aP ＜ 0.05，与低浓度组比较，bP ＜ 0.01

分组 动物数 6 h 24 h 48 h P 0 P 14 P 28对照组 8 0.91±0.07 0.96±0.04 0.95±0.05 0.97±0.03 0.96±0.03 0.95±0.05低浓度组 8 1.01±0.08 1.09±0.13 1.24±0.11a 1.01±0.09 1.22±0.12a 1.09±0.13高浓度组 8 2.62±0.21ab 2.49±0.17ab 2.51±0.13ab 2.21±0.15ab 1.89±0.14ab 1.69±0.19ab F值 399.00 364.37 524.52 378.31 158.33 66.83 P 值 ＜ 0.01 ＜ 0.01 ＜ 0.01 ＜ 0.01 ＜ 0.01 ＜ 0.01

图6 妊娠中期七氟醚暴露6 h后，免疫印迹检测胎鼠脑组织中BAX，BAD，VEGF，PI3K，p-AKT和AKT的表达水平

妊娠中期是胚胎神经发育的重要时期，在此期间，大脑中神经前体细胞通过增殖、凋亡、迁移和分化逐渐形成海马组织[11]。因此，在此期间接触麻醉药物会影响神经干细胞的数量和功能，从而导致中枢认知功能障碍[12]。在本研究中，发现在妊娠中期接触高浓度七氟醚可以使胎儿大脑以及出生后子代的海马组织中的神经干细胞数量减少，由于神经干细胞数量的减少会影响后续海马发育并导致学习和记忆功能障碍。TUNEL和Nestin的免疫荧光染色显示高浓度七氟醚所引起神经干细胞凋亡作用会持续到出生后的第14天。这提示保护性或代偿性机制可能在出生后第28天能在一定程度上减少凋亡神经干细胞的数量。然而，这种保护机制并不能逆转高浓度七氟醚的神经损伤效应。同时本研究观察到在高浓度七氟醚组中，与七氟醚暴露后的6、24和48 h的胎鼠相比，出生后第0天的幼鼠的细胞凋亡降低，因此推测随着时间的推移，胎儿会启动某种类型的补偿机制。但是，由于妊娠中期对海马组织发育至关重要，高浓度七氟醚造成的损害仍然存在。

VEGF对神经系统的发育至关重要，由于VEGF介导的血管生成对胚胎发育非常重要，VEGF的缺失会引发神经干细胞出现凋亡[13-14]。本研究结果首次发现，暴露于高浓度七氟醚会下调胎鼠大脑中的PI3K和p-AKT蛋白水平。既往研究表明，激活PI3K / AKT途径可减少麻醉诱导的神经干细胞凋亡，增强学习和记忆能力，例如采用米诺环素预处理激活PI3K / AKT途径以减少因接触氯胺酮引起的神经损伤并改善成年期的行为表现[15]；利用右美沙芬通过激活PI3K / AKT信号通路减少异丙酚诱导的细胞凋亡和认知障碍[16]，综合以上结果，认为高浓度七氟醚可通过抑制VEGF / PI3K / AKT通路从而诱导神经干细胞发生凋亡。

综上所述，本研究证实：临床实践中常用的低浓度七氟醚对神经干细胞凋亡或数量不会造成影响，这表明它可以在妊娠期妇女的手术中安全的使用，但是，高浓度七氟醚会导致神经干细胞发生凋亡和数量的减少，从而打破了细胞增殖和细胞死亡之间的平衡，扰乱了中枢神经系统的正常发育，导致后代的学习和记忆功能出现障碍。因此，应尽量避免在怀孕期间使用高浓度的七氟醚进行麻醉和手术。