外泌体MicroRNA-1246促进星形胶质瘤细胞增殖与侵袭的研究

解学军 张冰

神经胶质瘤是最常见的高致死率恶性脑部肿瘤，尽管手术切除、化疗与放疗等手段已经极大地改善了患者的预后，但患者的生存期仍然较短[1-2]。预后较差的主要原因之一是胶质瘤细胞常常会侵入中枢神经系统，造成肿瘤细胞的侵袭和转移，给治疗带来很多困难[3-4]。近年来，大量研究已经表明microRNA（miRNA）的异常表达在恶性神经胶质瘤的发生与发展过程中起到重要作用，miRNA通过调节关键蛋白的表达，能够极大地影响肿瘤的增殖与侵袭。

越来越多的研究表明，外泌体在细胞间起到了重要的通讯作用[5]。外泌体进入血液循环后，其携带的miRNA等物质会影响癌症的发展和转移等过程[6]。细胞黏附分子1（cell adhesion molecule 1，CADM1）介导细胞的接触抑制作用，抑制肿瘤细胞的转移和增殖，因此是一种肿瘤抑制因子[7-8]。研究显示，miRNA-1246可促进肝癌的转移与侵袭[9]，因此胶质瘤的高侵袭性，是由miRNA-1246介导的CADM1表达水平变化导致。本研究旨在探究血液循环中胶质瘤来源的外泌体，是否通过miRNA-1246作用于CADM1促进胶质瘤的增殖与迁移，为胶质瘤的早期诊断与治疗提供新的靶点。

材料与方法

一、实验材料

1.组织样本：从赤峰学院附属医院2015至2017年住院的恶性胶质瘤患者中随机挑选30位与健康志愿者中随机挑选30位纳为本次研究对象。排除标准：（1）严重心脏、肝脏、肾脏、肺功能不全；（2）合并感染、肿瘤、免疫性疾病；（3）合并血液系统疾病。该研究通过了赤峰学院附属医院伦理委员会的批准，所有患者都签署了知情同意书。所有组织在切除后立即冰冻并保存于-80℃，以备进一步实验。

2.细胞系：U-118 MG人脑星形胶质母细胞瘤（北京北纳生物公司）。

3.实验试剂：DMEM培养基（美国Gibco公司），Lipofectamine 2000（美国 Invitrogen公司），外泌体分离试剂（美国Invitrogen公司），双萤光素酶报告基因检测试剂盒，RIPA裂解液，PMSF，BCA蛋白浓度测定试剂盒，SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，CCK8试剂盒，cDNA第一链合成试剂盒与Trizol（上海碧云天生物公司），CADM1一抗（武汉博士德公司），HRP标记的二抗（武汉博士德公司）。

二、实验方法

1.胶质瘤细胞系培养与转染：U-118 MG细胞培养于含10﹪胎牛血清与1﹪青霉素-链霉素的高糖DMEM培养基中，培养环境37 ℃，含5﹪CO2。在细胞生长至90﹪密度时，以Lipofectamine 2000作为转染试剂按照操作说明将miRNA-1246模拟物或抑制剂转染至细胞内，每孔加入50 μl培养基稀释的 2 μl Lipofectamine 2000。

2.外泌体提取与鉴定：使用外泌体分离试剂从人血清中分离外泌体。500 μl血清2 000×g离心30 min 去除杂质，吸取 300 μl与 60 μl分离试剂混合，4 ℃孵育30 min，室温下10 000×g离心10 min，吸弃上清液，加入150 μl PBS重悬，4 ℃保存备用。外泌体多聚甲醛固定后滴加到铜网上，乙酸双氧铀负染，使用透射电子显微镜观察外泌体的形态。

3.细胞侵袭实验：使用Matrigel基质胶包被的Transwell小室测定U-118 MG细胞的侵袭迁移能力。实验分为对照组、miRNA-1246抑制剂组与miRNA-1246模拟物组，各组设6个复孔。加100 μl无血清培养基细胞悬液至Transwell上室，600 μl培养基（10﹪血清）加入下室。24 h后取出小室，PBS溶液洗涤后甲醇固定30 min，0.1﹪结晶紫染色20 min，镜下观察。

4.细胞增殖检测：使用CCK-8试剂盒检测细胞增殖。实验分为对照组、miRNA-1246抑制剂组与miRNA-1246模拟物组，各组设6个复孔。U-118 MG细胞贴壁于96孔板并培养48 h后，每孔加入10 μl CCK-8试剂，继续培养2 h，使用酶标仪测定450 nm处吸光度值。

5.Western Blot：在冰上使用RIPA裂解液裂解组织标本或U-118MG细胞，4 ℃条件下12 000×g离心20 min后收集上清液，使用BCA试剂盒测定蛋白浓度。混合蛋白与上样缓冲液后进行SDS- PAGE电泳分离蛋白。随后转至PVDF膜，封闭液封闭，CADM1一抗4 ℃孵育过夜，HRP标记的二抗室温孵育2 h。化学发光底物工作液处理后，置于Tanon-5200化学发光分析系统内显影。使用GAPDH作为内参。

6.RNA提取与定量RT-PCR：使用Trizol按照常规方式提取组织与细胞或外泌体中的RNA[10]。使用cDNA合成试剂盒合成cDNA第一链。随后使用SYBR Green I染料在CFX Connect 荧光定量 PCR检测系统中进行RT-PCR，以GAPDH做归一化处理。使用2-ΔΔCt法对RNA水平进行相对定量。miRNA的荧光定量使用miRNAqRT- PCR系列试剂盒进行。引物序列如下：GAPDH上游引 物：5'-CTCAGTTGCTGAGGAGTCCC-3'，下游：5'-ATCGAGAGAAGGGAGGGCT-3'；CADM1上 游：5'-TCAACACGCCGTACTGTCTG-3'，下游：5'-GTGGGAGGAGGGATAGTTGTG-3'；miRNA-1246：5'-AATGGATTTTTGGAGCAGG-3'。

7.报告基因构建与荧光报告实验：包含CADM1 3'非翻译区的报告基因pGL3载体质粒由吉玛基因合成（CADM1-WT）。同时也合成了结合位点突变的报告基因（CADM1-Mut）。细胞在24 孔板培养至贴壁后，以100 ng每孔的浓度转染至U-118MG细胞，同时转染的还有miRNA-1246模拟物和模拟物对照组，每组设置3个复孔。转染24 h后使用双萤光素酶报告基因检测试剂盒检测各组荧光强度。

三、统计学分析方法

采用SPSS 19.0 软件进行统计分析，蛋白水平、RNA水平、侵袭细胞数量、450 nm吸光度和荧光强度以表示，两组间比较采用t检验，CADM1蛋白与miRNA-1246含量的关系采用直线相关法分析多组间及两两比较采用方差分析和SNK-q检验，线性回归分析检测负相关性。以P＜ 0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、恶性胶质瘤患者血液外泌体中miRNA-1246含量检测

从患者和健康志愿者血液中提取外泌体并进行观察。透射电子显微镜结果表明，外泌体呈球形，直径约40 ～ 100 nm（图1）。随后使用Western Blot检测了外泌体的特异性表面标志蛋白CD63与HSG101（图2）。定量RT-PCR检测外泌体内miRNA-1246水平，结果表明患者来源外泌体内miRNA-1246 浓度高于对照组（P＜ 0.05，图 3）。

图1 透射电镜观察外泌体（×1000）

图2 Western Blot检测表面标志蛋白CD63与HSG101

图3 外泌体miRNA-1246水平检测

二、U-118MG细胞增殖与侵袭检测

图4 普通显微镜下观察胶质瘤细胞侵袭能力（结晶紫染色，×200）

CCK-8实验检测了U-118 MG细胞在转染了miRNA-1246模拟物或抑制剂之后增殖能力，结果表明，转染了miRNA-1246模拟物的细胞增殖能力高于未转染的对照组；相反，转染抑制剂之后细胞增殖能力则降低（P＜ 0.01，表 1）。Transwell实验结果也表明，miRNA-1246模拟物会提高U-118 MG细胞侵袭能力，miRNA-1246抑制剂则相反（P＜ 0.01，图 4，表 1）。

表1 U-118 MG细胞转染后侵袭数量与CCK-8实验（x± s）

三、荧光素酶报告实验检测

使用荧光素酶报告实验检测miRNA-1246是否作用于CADM1。将CADM1-WT或CADM1-Mut转染至事先转染了miRNA-1246模拟物或模拟物对照组的U-118 MG细胞48 h后检测各组的荧光强度。结果表明，转染CADM1-WT后，miRNA-1246模拟物组的细胞相对荧光强度为4.98±1.86，低于miRNA-1246模拟物对照组10.34±2.60（t= 7.235，P= 0.006），而转染了CADM1-Mut的细胞间比较差异没有统计学意义（miRNA-1246模拟物对照组：9.71±1.62，miRNA-1246模拟物组：9.53±1.47）。为了检测miRNA-1246是否会影响CADM1的表达，测定了U-118 MG细胞转染miRNA-1246抑制剂前后CADM1的mRNA和蛋白水平。结果表明，转染miRNA-1246抑制剂后CADM1 mRNA水平没有变化，miR-1246抑制剂对照组蛋白含量为1.17±0.11，低 于 miR-1246抑 制 剂 组 1.84±0.15（t= 11.68，P= 0.014）。

四、胶质瘤样本蛋白与基因水平检测

检测了胶质瘤样本与癌旁正常样本中CADM1蛋白的含量，并研究其与对应患者血液外泌体中miRNA-1246含量的关系。结果表明，相对于癌旁正常组织1.00±0.26，胶质瘤组织中CADM1蛋白含量降低0.48±0.31（P= 0.004）。在胶质瘤组织中，CADM1蛋白含量与miRNA-1246水平也呈负相关关系（r= -0.88，P＜ 0.05，图 5）。

图5 质瘤组织中CADM1蛋白含量与外泌体miRNA-1246水平的关系

讨 论

星形胶质细胞瘤是最常见的胶质瘤，具有较高侵袭性，导致难以完全手术切除[11]。外泌体近年来成为研究热点，许多研究已经证明其在肿瘤的发生、发展与转移过程中起到重要作用。肿瘤细胞分泌的外泌体携带特异性小分子或RNA，能够影响其他细胞的生物学功能，从而调节癌症进程[12]。miRNA作为一种长度不超过25个核苷酸的非编码单链RNA分子，能够参与转录后基因表达调控[13]。研究表明，肿瘤细胞来源的外泌体中携带有各种miRNA，例如，非小细胞肺癌来源的外泌体携带miR-222-3p，会增强癌症耐药性，促进细胞的迁移侵袭能力[14]。miRNA-1246是一种促癌因子，研究表明其能够增强肝癌细胞的迁移与侵袭能力[15]。结直肠癌细胞分泌的囊泡含有miRNA-1246，能够促进肿瘤部位的血管生成[16]。本研究通过实验探究了胶质瘤细胞外泌体中的miRNA-1246是否能够抑制CADM1从而增强细胞的增殖与侵袭活性，影响恶性胶质瘤进展。

首先分离并分析了胶质瘤患者与正常人血液的外泌体，RT-PCR结果证明了患者来源的外泌体包含有更多的miRNA-1246。随后笔者用星形胶质瘤细胞系U-118 MG进行体外实验。在U-118 MG细胞转染miRNA-1246模拟物或者抑制剂后，使用Matrigel基质胶包被的Transwell实验检验其侵袭能力，结果表明miRNA-1246能够增强胶质瘤细胞的侵袭能力，而抑制miRNA-1246后，细胞的侵袭能力减弱。CCK-8实验结果也表明，miRNA-1246增强了胶质瘤细胞的增殖活性，抑制后则相反。为了验证miRNA-1246作用于CADM1的机制，笔者进行了荧光素酶报告基因实验，结果表明miRNA-1246能够作用于CADM1的3'非翻译区，从而抑制CADM1蛋白的表达。由于CADM1介导了细胞的接触抑制作用，抑制了肿瘤细胞的转移和增殖，因此CADM1蛋白表达被抑制后胶质瘤细胞的增殖与侵袭能力增强，促进了胶质瘤的转移。随后对胶质瘤样本的检测也进一步证明，患者胶质瘤组织内CADM1蛋白含量降低，与对应的外泌体内miRNA-1246含量成反比。

本文的研究证明，恶性星形胶质瘤分泌的外泌体中miRNA-1246含量增多，其可作用于CADM1 mRNA的3'非翻译端，抑制了CADM1蛋白的表达，从而导致胶质瘤细胞的增殖与侵袭能力增强，促进了恶性星形胶质瘤的转移。本研究发现了胶质瘤转移的分子机制，为胶质瘤的早期诊断与治疗提供新的靶点。