微卫星不稳定性在散发性结直肠癌中的研究现状及展望

李会晨 李梓萱 洪洙

结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，在我国其发病率和死亡率分别位于恶性肿瘤的第3位和第5位，每年新增25万多病人和约14万人死于该疾病[1-2]，其中散发性结直肠癌(sporadic colorectal cancer，SCRC)约占85%，遗传性非息肉结直肠癌 (hereditary nonpolyposis colorectal cancer，HNPCC)约为10%～15%[3]。SCRC主要受环境、饮食、生活习惯、慢性炎症的影响从而引发“管理员基因”和“门卫基因”的突变，使得抑制细胞生长、促进细胞死亡和维持细胞稳定性的机制被打乱，其中微卫星不稳定性(microsatellite instability, MSI)参与了SCRC的发生，其发生率为12%～15%[4]。目前的研究表明MSI状态与SCRC的预后以及肿瘤对化疗药物的敏感性相关，本文将围绕MSI在SCRC中的研究现状及其展望进行综述。

一、微卫星DNA与MSI

微卫星DNA，是由1～6个核苷酸组成的简单串联重复的DNA序列，常见的有2、3、4核苷酸重复序列，尤其以二核苷酸的重复序列(CA/GT)n最为常见[5]。1981年Miesfeldd等[6]首次发现微卫星DNA, 后发现其广泛分布于真核生物的基因组中，约占真核基因组的5%。

MSI是指肿瘤细胞与正常的组织细胞相比，由于重复碱基的缺失或插入而导致的正常微卫星长度改变的现象[7]。该现象是错配修复基因MLH1、PMS2、MSH2、 MSH6、MLH3、MSH3等变异引起，进一步导致细胞增生及分化异常，从而促进肿瘤的发生。2001年Fukushima等[8]研究发现，MSI的发生显著提高了基因的随机突变率，尤其是导致了肿瘤相关基因的突变，是引起肿瘤发生的一个重要机制。2010年Iacopetta等[9]也发现MSI能够导致多种抑癌基因如转化生长因子β受体2和编码BAX蛋白的基因失活，同时活化一些癌基因如BRAF基因，从而促进结直肠癌的发生。

二、MSI与SCRC的相关性

1993年，Thibodeau等[10]首先在HNPCC发现MSI现象，随后在各种散发性肿瘤如胃癌、子宫内膜癌、乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌中均发现存在MSI。研究表明，结直肠癌MSI总发生率在15%～20%，其中SCRC为12%～15%。1997年Kane等[11]通过免疫组织化学技术对66例SCRC样本的研究结果表明，hMLH1表达缺失与hMLH1基因启动子甲基化存在相关性。2005年董锐增[12]对70例散发性多原发大肠癌病人的124个存档蜡块和随访3年以上的35例散发性单原发大肠癌病人的肿瘤组织进行MSI测定，发现散发性多原发大肠癌中25.8%的肿瘤表现高度微卫星不稳定(high-frequency microsatellite instability, MSI-H),单原发大肠癌为5.7%，其中同时多原发大肠癌MSI阳性率为15.6%，异时多原发大肠癌为36.7%，MSI可以作为一个重要的独立的危险因素预测异时大肠癌的发生，亦可作为一个重要指标判断散发性多原发大肠癌病人的预后。2006年Sarli等[13]随机选择108例SCRC病人，对抑癌基因p27的表达和MSI状态之间的相关性进行研究，结果显示59%MSI的SCRC中p27基因表达发生改变，而微卫星稳定的SCRC中改变率仅为24%，推测MSI可能参与了SCRC的发生。同年Dove-Edwin等[14]研究数据显示HNPCC从小腺瘤到癌的转变仅需3～5年，而大多数散发癌则需要20～40年。发病年龄上，通常散发性 MSI 结直肠癌比Lynch综合征的病人发病年龄大[12]。2007年Sinicrope等[15]对329例结直肠癌病人的MSI展开研究，发现MSI与SCRC的发生、发展相关，而且MSI仅在肿瘤细胞中发现，未在与肿瘤相邻的正常组织及周围血白细胞中被发现[15]。

这些研究证实MSI与SCRC发生密切相关， 也有文献报道MSI-H的SCRC病人通常伴随着BRAF-V600E突变。2004年Deng等[16]对26株结直肠癌细胞系、80例SCRC以及20例HNPCC样本的BRAF基因突变和hMLH1基因甲基化进行研究，发现BRAF基因突变高频出现在hMLH1甲基化的SCRC中(87%)，而HNPCC中没有检测到BRAF基因突变，SCRC的MSI通常伴随着BRAF基因突变。同年Domingo等[17]检测206例MSI-H的SCRC样本和111例HNPCC样本的BRAF-V600E突变，结果显示40% (82/206) MSI-H的 SCRC样本中检测到BRAF-V600E突变，而HNPCC中都没有检测到，MSI结合BRAF-V600E与SCRC发生密切相关。2010年Hall等[18]发现BRAF V600E突变仅见于MSI 高的SCRC中。2011年Fearon[19]也发现MSI-H的SCRC中，很大一部分是由 MLH1启动子 CpG 岛超甲基化所引起，通常与 BRAF-V600E突变有关。2015年Karahan等[20]研究结果表明 IHC 标记的相关蛋白与 MSI 肿瘤的病理特征相关，如 MLH1、PMS2 表达缺失与病发于右半结肠、黏液样分化差、密集的淋巴细胞浸润相关。错配修复(MMR)蛋白表达缺失可能预示肿瘤的低度恶性；MSH2 和 MSH6 的表达缺失率随着 SCRC 肿瘤体积的增大而增加，其表达可能参与SCRC肿瘤的进展过程；MLH1与MSH2基因的突变始终作用于SCRC 肿瘤的发展[21]。2016年汪加亮等[22]研究显示结直肠癌高频微卫星不稳定与 BRAF 基因突变之间存在密切关系，并且微卫星不稳定及 kras基因等与疾病预后同样具有密切关系。2015年Hurtado等[23]的研究发现，MSI-H现象和BRAF突变常多见于右半结肠，推测右半结肠癌和左半结肠癌存在不同的分子学特征， MSI或 BRAF突变的结肠癌病人发生肿瘤扩散的可能性较小，而存在kras突变者肿瘤扩散可能性增加。

三、MSI预测结直肠癌病人预后

多项研究证实MSI状态可预测结直肠癌病人预后。2005年Popat等[24]对32项研究Meta分析，共计7 642例Ⅰ～ Ⅳ期的结直肠癌病人，其中1 277例为MSI-H的结直肠癌病人，分析结果显示MSI-H的结直肠癌病人的预后显著优于微卫星稳定性(microsatellite stable, MSS)的结直肠癌病人：MSI-H的病人的总生存风险比为0.65(95%置信区间为0.59～0.71)，MSI-H结肠癌病人的死亡率比非MSI-H肿瘤病人低35%左右。2012年Roth 等[25]对1 404例年龄在14～76岁 Ⅱ/Ⅲ期结直肠癌术后病人追踪观察，研究结果表明与MSS的结直肠癌相比，MSI-H的结直肠癌病人预后更好，无病生存期(disease-free survival,DFS)和总生存期更长(overall survival,OS)。2016年Kim等[26]对2 940例经过根治性手术的Ⅰ～Ⅲ期结直肠癌病人(其中MSI-H病人261例)临床观察发现，与MSS和低度微卫星不稳定(low frequency microsatellite instability, MSI-L)病人相比，MSI-H病人具有更好的DFS和OS。

四、MSI与化疗药物的相关性

化疗是结直肠癌病人术后一个重要的辅助治疗手段，多名学者就结直肠癌性和散发性MSI与化疗之间相关性进行研究。2010年Sargent等[27]对457例Ⅱ期、Ⅲ期结直肠癌病人采用5-Fu为基础的化疗方案治疗，发现具有MMR缺陷的病人并没有体现出更好的生存率，甚至MMR缺陷的Ⅱ期结直肠癌病人术后总体生存率明显降低。2010年Vilar等[28]研究发现5-Fu用于 MSI高的Ⅱ期结直肠癌病人的辅助化疗无益，提示可能与病人的错配修复缺陷相关。由于预后良好且5-Fu辅助化疗疗效欠佳。2009年Jover等[29]以505例Ⅱ和Ⅲ期术后结直肠病人为研究对象，5年随访发现76例MSI-H病人并未从5-Fu辅助化疗方案中获益。2010年Guastadisegni 等[30]MSI状态对结直肠癌病人接受5-Fu化疗的临床意义进行了Meta分析，纳入31项研究共计12 782例病人，结果证实病人的MSI状态均与其DFS和OS相关。MSS病人可以从5-Fu辅助化疗中获益，而MSI-H的病人的生存结局尚未显示有统计学意义。

五、MSI检测技术

目前，临床中的MSI检测方法主要有聚合酶链反应(PCR)法和免疫组织化学(IHC)法。

1.PCR法 临床主要采用多重荧光PCR结合毛细管电泳进行MSI检测。MS位点经过荧光标记的PCR扩增后经毛细管电泳进行基因组扫描，通过检测片段长度来判断MSI状态[35]。微卫星标志物位点一般有BAT-25、BAT-26、MONO-27、NR-21、NR-24单核苷酸位点和D2S123、D5S346、D17S250、PENTA-C、 PENTA-D多核苷酸位点[36]。将肿瘤组织与对应的正常组织比较，如果有超过30% 的重复位点显示 MSI，则该病人为MSI-H型结直肠癌病人；如果少于30% 的重复位点显示MSI，则该病人为MSI-L型的结直肠癌病人；如没有重复位点显示MSI，则为MSS型的结直肠癌病人。如果检测结果为MSI-H/L阳性，应继续检测BRAFV600E突变情况和MLH1启动子CpG岛超甲基化情况，如BRAF V600E 突变检测结果为阳性，诊断为SCRC。如MLH1启动子CpG岛超甲基化检测结果为阴性，可结合生殖系DNA基因检测证实为Lynch综合征相关的结直肠癌[37]。

2.IHC法 IHC检测法是对MLH1、MSH2、MSH6、PMS2蛋白的表达情况来判断MSI状态的检测方法。2011年Stevenson等[35]发现人类的MMR系统一般优先通过hMutSα和hMSH2、hMSH6β形成的异二聚体识别复制过程中产生的错误，然后招募hMutLα启动DNA修复过程。如MSH2、MSH6 或PMS2 的检测结果异常，则通过生殖系DNA基因检测证实为Lynch综合征相关的结直肠癌；如MLH1的检测结果异常，则继续进行BRAF-V600E突变和MLH1启动子 CpG 岛超甲基化检测，以区分SCRC和Lynch综合征相关的结直肠癌，若BRAF-V600E 突变或 MLH1 启动子CpG岛超甲基化检测结果为阳性，则诊断为SCRC。如 BRAF-V600E 突变和 MLH1 启动子 CpG 岛超甲基化检测结果均为阴性，再通过生殖系 DNA 基因检测证实为 Lynch 综合征相关的结直肠癌。最常见IHC法检测结果是MSH2 和 MSH6染色正常，而MLH1 和PMS2 同时缺失，表明病人可能是 Lynch 综合征相关的结直肠癌或MMR蛋白缺失的SCRC，需进一步检测 BRAF-V600E 突变和MLH1 启动子 CpG 岛超甲基化来予以区分[38]。其他少见的MMR蛋白缺失，如 MSH2、MSH6同时缺失或MSH6、PMS2 的孤立缺失，极有可能是因基因生殖系突变导致的Lynch 综合征，可对病人的血白细胞 DNA 或正常组织进行生殖系突变分析来予以明确。

对MMR蛋白缺失的结直肠癌可统称为MMR缺陷的结直肠癌，临床意义上等同于MSI-H的结直肠癌,而MMR蛋白表达完整的结直肠癌则为MSS或MSI -L的结直肠癌[38]。MSI的PCR法和IHC法检测均具有高敏感性和特异性。2009年Palomaki 等[39]经过研究发现PCR 法和 IHC法检测的一致性>92%。

六、结语

SCRC的病因和发病机制非常复杂，MMR基因变异导致的MSI是其中一个重要因素，多项研究证实MSI-H的结直肠癌的筛查在临床上具有重要意义，不仅可预测病人的预后，而且可指导病人的化疗治疗。尽管如此，在化疗用药方面学术上仍存在争议，这就需要未来更加精细、更多样本的临床试验来验证。未来MSI 状态可能是选择个体化治疗方案的关键指标。伴随着基因检测技术的不断发展，结直肠癌发生发展的分子机制将进一步被揭开，这将为结直肠癌的早期诊断、早期预防以及靶向治疗提供基础，MSI 状态也有望成为多种癌症病人的重要预后预测标志物[40-42]。

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