MiR-3622a通过LASS2调控对膀胱癌细胞的生物学行为影响

蒋昌毅，柯昌兴，叶枝能，黄 津，龚年东，王海峰

(1.昆明医科大学第二附属医院泌尿外科,云南昆明 650101；2.普洱市中心医院泌尿外科,云南普洱 665000)

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，其发病率呈逐年上升趋势[1]，男性的发病率高于女性[2]。近年来，随着基因治疗在临床中的开展，寻找膀胱癌的分子靶点对临床的治疗、预后具有十分重要的意义。微小核糖核酸(microRNAs，miRNAs)在真核细胞中广泛存在，调控着细胞的生物学功能[3]。文献报道，miRNAs 调节近30%的人类基因组蛋白编码基因[4]，可负性调控靶基因使基因的转录水平下降。miR-3622a具有与miRNAs类似的特性，在相应的疾病进程中起到一定的调控作用[5]。人源性长寿保障基因2(homo sapiens longevity assurance homologue2，LASS2)，也被命名为肿瘤转移抑制因子，目前已被证实LASS2在前列腺癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌等多种肿瘤中发挥着抑癌基因的作用[6]。在本研究中，我们构建miR-3622a mimic表达载体，并转染膀胱癌细胞EJ、BIU、RT4，探讨miR-3622a通过LASS2调控对膀胱癌细胞增值、迁移能力的影响，为膀胱癌远期的基因治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1材料膀胱癌细胞株EJ、BIU、RT4(昆医附二院中心实验室)、RPMI(美国Hyclone公司)、胎牛血清购(南美乌拉圭CELL-BOX公司)、Trizol(日本TaKaRa公司)、FastKing cDNA第一链合成试剂盒、Talent荧光定量检测试剂盒(中国北京天根生化公司)；引物(昆明硕擎公司)、LASS2一抗和Beta-Actin一抗和羊抗兔二抗HRP标记(美国Millipore公司)、CCK-8(中国汉恒生物有限公司)；全自动凝胶图像分析(美国Bio-rad)、荧光定量PCR仪7000型(美国ABI公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养 含10%胎牛血清的细胞培养基(RPMI)培养膀胱癌细胞株，于37 ℃、5%CO2(体积分数)培养箱中孵育，每2 d传代1次。

1.2.2细胞转染 按照汉恒生物转染试剂说明书进行转染。转染前1 d，将3×105/孔EJ、BIU和RT4细胞分别接种到2 mL含10%胎牛血清的RPMI培养液的6孔板进行培养，使细胞能够在24 h细胞密度为80%～90%左右。按照以下方法准备miR-3622a mimic，miR-NC mimic，脂质体转染试剂(Lipofiter)复合物：①以250 μL减血清培养基( Opti-MEMRI)稀释7.5 μL Lipofiter转染试剂，轻轻混匀，室温条件下孵育5 min；②以250 μL Opti-MEMRI稀释miR-3622a mimic或miR-NC mimic3 μg，混匀，室温条件下孵育5 min；③将①转入②中，清清吹打混匀，在室温条件下孵育20 min，以利于形成复合物。将③复合物均匀加入6孔板中，转染后12 h更换培养基。37 ℃条件下，5%CO2(体积分数)培养箱继续孵育48 h。

1.2.3总RNA提取和cDNA合成 按照TAKARA试剂说明书提取细胞总RNA。用紫外分光光度仪在A260/A280检验RNA纯度并计算其浓度。cDNA第一链合成反应体系：5×gDNA缓冲液 2 μL，总RNA 50 ng～2μg；10×King RT Buffer 2 μL，FastKing RT Enzyme Mix 1 μL，FQ-RT Primer Mix 2 μL，RNase-Free dd H2O至总体积20 μL。反应条件为：42 ℃，60 min ；95 ℃，3 min。所获得cDNA于-20 ℃保存备用。

1.2.4实时定量逆转录聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR) LASS2选用GAPDH作为内参基因，引物、反应体系、反应条件如下：GAPDH F为5′-GTCAAGGCTGAGAACGGGAA-3′，GAPDH R为5′-AAATGAGCCCCAGCCTTCTC-3′；LASS2 F为5′-GGTCCCTGCTCTTCAGCATT-3′，LASS2 R5′-CATCTTGGCTGACTCCAGCA-3′。20 μL反应体系： cDNA 2 μL，正向引物(Forward Primer)0.6 μL，反向引物(Reverse Primer)0.6 μL，2×Talent qPCR PreMix10 μL，50×ROX Reference Dye 20.4 μL，RNase-Free ddH2O 6.4 μL。反应条件为：预变性95 ℃ 3 min，变性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 10 s，延伸72 ℃ 30 s共40个循环。每个样品3个复孔，重复3次实验，实时定量分析采用2-ΔΔCt方法。

1.2.5Western blot实验 提取细胞总蛋白，通过BCA法进行蛋白定量，上样，SDS-PAGE电泳至溴酚蓝到凝胶底部后转膜，转完后将膜移至含封闭液的平皿中，室温摇床封闭1 h。将LASS2一抗与封闭液以1∶1 000稀释，膜上加入一抗并4 ℃过夜孵育，用TBST在室温摇床上洗膜4次，每次8 min。二抗与封闭液以1∶8 000稀释，室温孵育1 h,TBST洗膜4次，每次8 min。反应结束后进行ECL化学发光反应，用Bio-rad凝胶系统分析目的条带和内参分子量。

1.2.6细胞活力 用miR-3622a mimic，miR-NC mimic转染EJ、BIU、RT4细胞，转染成功的细胞培养48 h，用PBS漂洗2次，胰酶消化制成单个悬液细胞。调整细胞密度以每孔5 000个(200 μL)细胞接种于96孔培养板内,每组实验设3个复孔,按照每孔10 μL CCK-8加入96孔培养板内，37 ℃，5%CO2的细胞培养箱内孵育4 h，分别于第1天,第2天,第3天,第4天用酶标仪在490 nm处测定各孔溶液的吸光度值(A)，计算细胞活力。

1.2.7划痕实验 用笔在6孔板背后均匀地划横线3条，每条间隔约0.5 cm。每个实验组均重复3次。用转染后的细胞，铺于6孔板中，待培养细胞密度为100%时，每孔垂直划线3条，用PBS洗去划下的细胞2次，加入含10%血清培养基继续培养，分别取划线后6、24、32 h为时间点在倒置显微镜下观察划痕修复过程并拍照记录。

1.3统计学分析所有数据进行正态性检验分析，用均数±标准差表示，多组间比较采用方差分析，P<0.05表示统计有差异。数据分析应用SPSS软件进行处理。

2 结 果

2.1膀胱癌细胞株miR-3622a的转染我们选择了3株膀胱癌细胞系EJ、BIU、RT4行细胞转染，通过Lipofiter转染试剂和构建的质粒顺时转染入细胞检测其细胞转染效率。结果EJ细胞转染效率达50%，BIU达70%，RT4达60%(图1)。

2.2miR-3622a对LASS2基因表达的影响我们将miR-3622a mimics转染至具有不同LASS2表达水平的膀胱癌EJ、BIU、RT4细胞中，与阴性对照组(miR-NC mimics)，空白组(Control)相比。通过RT-qPCR、Western-blot检测显示miR-3622a mimics转染后均能有效抑制这3株膀胱癌细胞中LASS2 mRNA和蛋白的表达水平(图2、图3)。

图1荧光显微镜检测miR-3622amimics转染膀胱癌细胞结果(×100)
A:EJ细胞转染效率50%;B:BIU细胞转染效率70%;C:RT4细胞转染效率60%。

图2细胞荧光定量结果

RT-qPCR检测miR-3622a mimics转染膀胱癌细胞均能降低LASS2 mRNA表达水平;Control：空白组。

2.3细胞增殖实验为了验证miR-3622a是否能够通过负性调控LASS2表达，进而影响膀胱癌的增殖能力，我们进行了CCK8增殖实验。结果显示:EJ、BIU、RT43株膀胱癌细胞在铺板第1天,第2天,第3天,第4天，miR-3622a mimics组与miR-NC mimics组或Control组间的A490值均有显著性差异(P<0.05)，说明miR-3622a mimics能促进膀胱癌EJ、BIU、RT4细胞的生长(图4)。

图3 Western blot蛋白印记结果

条带分别显示LASS2和β-actin蛋白表达情况，转染miR-3622a mimics后，膀胱癌细胞LASS2 蛋白表达水平降低。Control：空白组。

图4CCK8增殖实验
MiR-3622a mimics转染后能促进膀胱癌细胞EJ、BIU、RT4增殖(P<0.05)。A: EJ;B: BIU; C:RT4。

2.4划痕实验为了检测miR-3622a是否能够调控LASS2影响膀胱癌的迁移能力，我们使用EJ、BIU、RT4细胞进行了划痕实验。miR-3622a mimics组、miR-NC mimics组和Control组均设3个平行样本，每个样本观测2个视野，采用Image J软件计算划痕面积，计算迁移率。结果显示，在划痕后32 h，miR-3622a mimics组的EJ、BIU、RT4细胞划痕面积低于miR-NC mimics组和Control组，迁移率的差异具有统计学意义(P<0.05)，提示miR-3622a mimics增加了EJ、BIU、RT4细胞的迁移能力(图5、图6)。

图5划痕实验各组细胞的迁移能力(×100)

图6划痕实验检测结果

miR-3622a mimics转染促进了膀胱癌EJ、BIU、RT4细胞迁移能力(P<0.05)，Control：空白组。

3 讨 论

膀胱癌的演变是一个与遗传、环境等多种因素密切相关的复杂过程[7]。随着分子生物的深入研究，人类基因组中超过90%的转录产物都不编码蛋白质[8],这些不编码蛋白质的RNA 被称为非编码RNA，miRNAs属于其一。miRNAs本身不直接参与编码蛋白，通过转录后识别mRNA的3′-UTR碱基，与碱基完全互补配对或部分配对影响靶基因mRNA的降解或翻译,在转录后水平调控靶基因的表达，影响蛋白质的合成，从而参与个体发育、机体代谢以及肿瘤的发生、发展等生命过程中一系列重要的生理和病理过程。在前期实验,课题组采用miRNAs芯片的检测方法初步筛选出miR-3622a在膀胱癌组织表达高于邻旁的癌旁组织。miR-3622a作为非编码RNA 的一员，定位于8 号染色体,具有着与miRNAs类似的特性，调控着疾病的进程。目前，miR-3622a结构有3种，分别为茎环结构的miR-3622a、成熟结构的5′磷酸miR-3622a 和3′磷酸miR-3622a[5]。

人源性长寿保障基因2(LASS2)属于LASS家族一员，又称TMSG1、CERS2，位于染色体1q11，其与酵母长寿保障基因LAGI之间具有高度同源性的人类基因。目前关于LASS2基因已经在多个研究中被证实，在包括肝癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌在内的多种肿瘤中发挥着抑癌基因的作用，与肿瘤的发生发展及其预后密切相关[9]。LASS2基因作为一个新发现的肿瘤抑制基因，抑制肿瘤的增值、迁移。LASS2蛋白通过与质子泵液泡型ATP酶中的C亚基结合，降低V-ATPase跨膜运输氢离子的能力，一方面使细胞内的氢离子增多，线粒体凋亡通路被激活，诱导细胞凋亡，肿瘤的生长被抑制；另一方面降低了细胞外的氢离子浓度，使基质金属蛋白酶家族等蛋白水解酶类失活，抑制肿瘤的侵袭和转移[10-11]。文献报道，在不同增殖和迁移能力的膀胱癌细胞株中LASS2 mRNA和蛋白的表达水平不同，且膀胱癌细胞的增殖和迁移能力与LASS2呈负相关[12]。

目前尚无miR-3622a靶向调控LASS2的相关报道。我们利用生物信息学方法，对miR-3622a的靶基因进行预测，分析miR-3622a与LASS2的关系。结果发现miR-3622a能与LASS家族中的LASS2、CERS3′-UTR均可直接靶向结合。因此本研究为了明确miR-3622a对LASS2在EJ、BIU、RT4细胞生物活性过程中的作用，先利用基因工程的手段在体外构建人miR-3622a mimic质粒表达载体，并将其转染入EJ、BIU、RT4细胞，通过RT-PCR、Western blot检测其对EJ、BIU、RT4细胞LASS2基因表达的效果。结果显示，与miR-NC、Contro组相比，miR-3622a mimic组能减少LASS2 mRNA和蛋白的表达量(P<0.05)，提示miR-3622a可直接作用于mRNA的3′-UTR碱基负性调控LASS2的表达。同时利用miR-3622a调控LASS2基因，探讨其对膀胱癌EJ、BIU、RT4细胞增值和迁移能力的影响。

肿瘤细胞的异常增殖与肿瘤的发生和发展密切相关，其无限增殖能力是肿瘤恶性程度的重要标志，这一病理过程涉及多因素的参与[13]。本研究通过细胞增殖实验分析过表达miR-3622a对EJ、BIU、RT4细胞增殖能力的变化。CCK-8检测结果显示转染后，miR-3622a mimic组比miR-NC、Control组细胞增值能力强，提示miR-3622a可能通过抑制LASS2的表达，促进细胞的增值(P<0.05)。miR-3622a 可能通过靶向调节LASS2转录后的mRNA的表达，增加V-ATPase跨膜运输氢离子的能力从而影响肿瘤细胞的增殖能力，进而在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。

细胞迁移是借助细胞头部伪足的延伸以及细胞体尾部收缩在时空上的交替过程，是细胞普遍存在的一种运动形式，而肿瘤细胞转移过程中迁移必不可少。本法借鉴体外细胞划痕实验模型测定膀胱癌肿瘤细胞迁移能力。结果显示：划痕处理32 h后，miR-3622a mimic组比miR-NC、Control组细胞愈合面积多，迁移能力强(P<0.05)。说明转染miR-3622a mimic到EJ、BIU、RT4细胞后，能增加细胞的迁移能力。

综上所述，miR-3622a可以有效的促进膀胱癌细胞的增值，迁移，可能通过与LASS2mRNA基因的靶向结合甚至是结合位点，减低LASS2转录后水平的活性，使LASS2基因mRNA和蛋白表达下降，从而促进膀胱癌细胞的增值和迁移。此研究为进一步探讨miR-3622a在膀胱癌发生发展过程中提供了新的思路，同时为膀胱癌的预防、诊断和治疗提供了研究基础。

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(编辑 王 玮)