脂肪干细胞治疗勃起功能障碍新进展

王明珠，罗莉，邱卓琳，朱建斌，李昊，蔡祥胜

1.西安市第四医院 生殖医学中心，陕西 西安 710004；2.南方医科大学南方医院 生殖中心，广东 广州 510515；3.广东唯泰生物科技有限公司 技术中心，广东 佛山 528000；4.广东药科大学 第一附属医院，广东 广州 510080

勃起功能障碍（erectile dysfunction，ED）严重影响患者及其配偶的生活。ED是多种疾病的结果，被定义为阴茎持续不能达到和（或）维持足够的勃起以获得满意的性生活。流行病学研究资料表明全球ED的高发病率。ED是由神经源性引起的内皮细胞或平滑肌功能障碍。例如，长期糖尿病导致内皮功能障碍，减少氮能神经信号，并增加了阴茎组织氧化应激，这反过来又导致一氧化氮合成下降、平滑肌松弛及海绵体细胞凋亡和纤维化[1]。而前列腺切除术后，ED是神经血管束直接受损的结果。前列腺切除术后，由于直接神经损伤或间接神经失用症，导致阴茎组织缺氧、纤维化和细胞凋亡，进而导致ED发生[2]。目前磷酸二酯酶5型抑制剂（phosphodiesterase type 5 inhibitor，PDE5-I）是 ED 患者的一线治疗选择[3]，其他方法如尿道内栓剂、阴茎假体等也用于治疗ED。多数情况下，PDE5-I治疗ED有效，但是对糖尿病相关ED和根治性前列腺切除术后ED的治疗效果差，因此，为这类患者提供有效的治疗方案成为临床难题。近10年来已经建立了糖尿病ED、前列腺切除术后ED动物模型，使得可以探讨疾病的发展和治疗方案，而其中一个令人欣喜的治疗方案是干细胞的使用。过去的20年里，研究者们在干细胞治疗方面取得了重大成就。最近，干细胞的应用已扩展到ED治疗。在此，我们简要综述干细胞治疗ED的相关研究进展。

1 干细胞

1998年，美国威斯康星大学的Thomson等报道发现人类胚胎干细胞[4]。随后，日本京都大学的山中伸弥发现了成体干细胞的再编程方法，可使分化的成体干细胞逆向分化为胚胎干细胞，被称为诱导多能干细胞[5]。该发现扩大了干细胞研究领域，并为疾病提供了新的治疗方案。

干细胞具有自我更新和分化潜能[6]。总体来说，分化为早期胚胎的称为胚胎干细胞，来自成熟组织的称为成体干细胞。与成体干细胞相比，胚胎干细胞可以分化为更多种细胞，并且可供分化的时间长。但是，考虑到胚胎干细胞研究的伦理争议较多，其临床研究受到很大限制，而成体干细胞则成为目前研究关注的热点。

干细胞具有特定的细胞表面标记物和转录因子。胚胎干细胞表面标记包括阶段特异性胚胎抗原（stage specific embryonic antigen，SSEA）3和4、肿瘤排斥抗原（tumor rejection antigen，TRA）1-60和1-81。首次发现的成体干细胞是源于骨髓的造血干细胞（hematopoietic stem cell，HSC）[7]，其次是骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）。MSC是脂肪组织、脐带血、胎盘和牙齿中发现的成体干细胞，表达几种细胞表面标记物 ，包 括 CD105、CD73、CD44、CD166和 CD54/CD102，同时，其缺乏HSC特征性表面标记物如CD14、CD34、CD45、CD11a及 CD31。人体内很多器官都具有成体干细胞，如心脏组织、脂肪组织、骨骼肌、睾丸细胞、内皮、肠和脑组织，有望用于修复受损组织[8]。

2 脂肪干细胞

脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）及其再生潜能于2001被发现[9]。通过全麻抽脂术（吸脂）分离脂肪干细胞，体外培养并加入适当的诱导因子可分化为脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞和成肌细胞等。脂肪组织中的ADSCs比骨髓MSCs数量高出100～500倍[10]。因此，皮下脂肪和内脏脂肪是获得ADSCs最简单和最实用部位。皮下脂肪中ADSCs的提取安全、微创、得率高。

尽管脂肪干细胞的存在已被证实，但精确定位仍然存在困难。我们现在知道ADSCs存在于基质干细胞龛中。更具体地说，研究表明它们位于脂肪脉管系统的微环境中[11]。实验结果证实ADSCs由于存在于脂肪组织中的不同血管干细胞群中，其分化潜能不同，取决于细胞所在环境[12]。

获得脂肪组织后，须用胶原酶溶解基质血管组分（stromal vascular fraction，SVF）[13]，分离出干细胞，然后根据特异性细胞标记分类干细胞，而定义这些细胞的表面标记物一直是很困难的事情。目前常用的特征标记分类包括CD29、CD34、CD105、CD73、CD90和CD105[14]。科学家在各种不同的培养基中培养ADSCs，并刺激其分化为软骨细胞、平滑肌和神经细胞[15-17]。

3 脂肪干细胞用于治疗ED

ADSCs在临床前期治疗ED中显示出巨大的再生潜能。研究发现，ADSCs治疗ED时可以改善海绵体神经挤压伤后勃起功能[18]。该研究可以作为前列腺切除术后的神经失用症模型。Albersen等在研究中使用这一模型，证明ADSCs和ADSCs衍生的细胞裂解物的识别机制和作用[19]。双侧海绵状神经损伤采用ADSCs、干细胞裂解物治疗后4周做勃起功能及阴茎组织学评价，与对照组比较，治疗后勃起功能显著恢复[20]。且神经型一氧化氮合酶（nNOS）显著高表达、平滑肌含量升高、纤维化程度减轻。事实上，并不是把干细胞移入后生长并分化，而是干细胞溶解物中可溶性因子的释放发挥旁分泌效应使勃起功能恢复[21]。

Fandel等研究自体脂肪组织来源SVF治疗方案是否和ADSCs一样，能够改善海绵体神经受损后勃起功能[22]。ADSCs和SVF治疗的动物nNOS阳性率显著大于对照组动物，但ADSCs治疗与SVF治疗的动物组中nNOS阳性率或颅内压/平均动脉压（ICP/MAP）无显著性差异。这些结果表明，神经元阳性反应与含nNOS神经纤维再生相关。为进一步阐明ADSCs依赖的勃起功能恢复机制，研究人员使用了胸腺嘧啶核苷类似物（EdU）标记的ADSCs，并在不同时间点追踪这些细胞。他们观察到在骨盆神经节（MPG）基质中细胞衍生因子1（SDF-1）的表达上调，这为向MPG募集ADSCs提供了信号。在募集到的ADSCs的组中观察到海绵体中神经再生和改善的平滑肌/胶原比。

Song等结合上述观察的神经营养因子，评价血管生成因子在海绵体神经损伤后勃起功能恢复中的作用。神经受损后采用海绵体内注射SVF后2周，观察到神经刺激性勃起的剂量依赖性反应。此外，他们发现血管生成因子，包括血管生成素1（Ang-1）、血管内皮生长因子（VEGF）、肝细胞生长因子的表达增加[23]。Castiglione等对阴茎硬结症大鼠模型进行被膜内注射人ADSCs的治疗，以评估ADSCs预防纤维化和改善勃起功能的效果[24]。对比之前更换不可逆损伤组织的研究，该小组评估了ADSCs预防急性炎症期阴茎硬结症的效果。治疗后5周，评价勃起功能并取阴茎组织进行蛋白质表达分析。结果表明，和对照组相比，ADSCs治疗组ΔICP、ICP/MAP显著增加，肿大组织明显减小；免疫印迹显示胶原蛋白Ⅲ和弹力蛋白增加。5周后检测到小部分干细胞，这一发现支持了旁分泌机制导致上述结果的假设。进一步的研究提供了更多对旁分泌机制的支持。例如，在体外培养时，干细胞释放细胞因子和生长因子进入其环境，类似于体内注射干细胞，提示干细胞可以作为一种治疗方法。

Gokce等用相同的大鼠模型评估ADSCs作为预防ED的措施和治疗方法[25]。结合已有研究，他们观察的2种治疗方法都有效增加了ICP和ICP/MAP值。为了解释可能的分子机制，他们也发现抗肝纤维化的酶浓度、基质金属蛋白酶（MMP）增加，金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP）减少。这一发现为Castiglione研究中胶原和弹性蛋白减少的机制提供了证据。最近，Gokce等报道基因编辑后ADSCs移植，具有或不具有干扰素α2b的ADSCs减弱了模型大鼠阴茎硬结症样改变并增强了勃起功能。这表明ADSCs具有临床应用的可能性，可阻止硬结症斑块的形成，或至少限制疾病的自然进展[26]。另一项研究表明，猪小肠黏膜下同源ADSCs的移植可保留和维持正常的勃起功能[27]。ADSCs的小肠黏膜下移植可诱导诱导型一氧化氮合酶（iNOS）转录上调及内皮型一氧化氮合酶（eNOS）、nNOS和VEGF下调。这一结果进一步支持修复损伤白膜可作为治疗阴茎硬结症的选择。

前列腺癌的放射治疗是另一个导致ED原因，ADSCs可以改善这类患者的勃起功能障碍。Qui等研究了ADSCs改善放疗诱导的ED大鼠勃起功能障碍[28]。接受放疗的大鼠勃起功能明显减弱，nNOS和海绵体平滑肌含量减少；而当放疗大鼠注射ADSCs后，勃起功能恢复，nNOS表达和平滑肌含量恢复。

Garcia等利用2型糖尿病大鼠模型研究ADSCs在治疗2型糖尿病ED中的作用[29]。通过提取自体腺体周围脂肪组织分离培养干细胞注入大鼠阴茎，并与对照组相比，观察到大鼠勃起功能改善、细胞凋亡减少、nNOS水平升高。以往研究表明，治疗第3周的组织内只有少量干细胞可见，表明细胞因子和生长因子通过旁分泌释放。

脂肪源性SVF移植也有助于糖尿病患者勃起功能的恢复。研究证实SVF通过恢复内皮、提高平滑肌含量、增加血管生成因子的释放，促进磷酸化eNOS产生和恢复阴茎神经纤维，改善勃起功能[30]。有趣的是，与常氧环境下培养的ADSCs相比，低氧预处理的ADSCs可更高程度地诱导血管生成因子表达，从而改善大鼠勃起功能[31]。

研究者也采用其他策略提高ADSCs的有效性，其中之一是基因工程技术。Chen等将VEGF基因转染ADSCs并将其移植到2型糖尿病大鼠ED模型中[32]，与单独使用ADSCs和VEGF相比，用表达靶基因的ADSCs组大鼠勃起功能显著改善。此外，还证明了VEGF转染ADSCs组能更好地恢复VEGF信号通路、增加内皮和平滑肌功能，这些都是恢复勃起功能的基础。

另一种用于增强ADSCs的策略是用生长因子包被的水凝胶和生物降解膜。Piao等研究了被聚乳酸-乙醇酸（PLGA）膜包被的ADSCs和脑源性神经营养因子（BDNF）对海绵体神经损伤大鼠模型的疗效[33]。与单独使用ADSCs或BDNF/PLGA膜组相比，使用PLGA膜包被ADSCs的治疗组更显著地改善了神经再生和勃起功能。随后，他们观察了BDNF/PLGA膜与含有碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的ADSCs凝胶相结合的治疗效果。这种治疗策略与采用ADSCs+BDNF/PLGA膜或单独使用bFGF相比，可以显著改善勃起功能至接近正常水平。

目前，ADSCs是惟一可以分离并自体移植的细胞类型。此外，已有商业化的自动ADSCs分离仪器。因此，就成本、风险、伦理和有效性而言，ADSCs在治疗ED的应用中有很大潜力[34]。

显然，ADSCs为今后治疗ED提供了一种有效的治疗方法。临床前各种ED动物模型为ADSCs治疗提供了证据，将会有更多支持干细胞安全性和有效性的研究。预计在不久的将来，医生们将能够采用ADSCs治疗ED。