CRISPR-Cas9技术在遗传性疾病基因治疗中的研究进展

梅雯，孙美涛，王唯斯，柴蓓蓓，张若鹏，王仁凤，熊伟

1.大理大学 a.基础医学院，b.第一附属医院，云南 大理 671000；

2.昆明市禄劝县汤郎卫生院，云南 昆明 651500

遗传性疾病严重威胁人类健康，一直是人类面临的难治性疾病之一，也是现代医学重要的研究领域。随着分子生物学理论与技术的发展，人们发现很多人类遗传性疾病与基因突变有关。目前，基因编辑技术如传统的锌指核酸酶（zincfinger nucleases，ZFNs）、转录激活因子效应物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）及最新的 CRISPR-Cas9［clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）/CRISPR associated endonuclease 9（Cas9）］技术在遗传性疾病基因治疗方面发挥了重要作用。CRISPR-Cas9技术作为一种新型基因编辑技术，其操作便利性和适用性引起了普遍关注。探究CRISPR-Cas9技术的作用机制是一个长期探索过程，已有研究表明CRISPR-Cas9是细菌用以保护自身对抗病毒或噬菌体的一种防护机制，也是一种对付病毒或噬菌体的基因武器。与其他基因编辑技术相比，CRISPR-Cas9设计更为简单，应用领域更为宽广[1-2]。迄今，科学家们利用CRISPR-Cas9技术可对目标序列进行精确的定位操作，在生物医药领域有着广泛的应用前景，为遗传性疾病、癌症及病毒感染性疾病等提供了新的治疗手段。我们整理了近年来的相关文献，将CRISPR-Cas9作用原理及其在遗传性疾病基因治疗中的应用、存在问题和展望做简要综述。

1 CRISPR-Cas9分子机制及作用原理

目前，根据Cas位点基因组织源性的不同将CRISPR-Cas系统分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型。Ⅰ、Ⅲ型CRISPR-Cas系统降解外源DNA时需多种Cas蛋白参与，形成结构复杂的切割复合体。Ⅱ型系统由CRISPR、向导RNA（gRNA）和Cas9组成，缺一不可。其中gRNA决定Cas9核酸酶特异性切割位点，由其5′端约20 bp碱基进行特异性识别，Cas9蛋白具有调节crRNA（CRISPR RNA）结构及剪切双链DNA的双重作用，其作用是特异性切割外源DNA位点。目前对CRISPR-Cas9系统的研究颇多，在多领域基因组编辑中发挥重要作用[3-4]。CRISPR-Cas9系统结构比较固定，由5′端的反式激活 crRNA（tracrRNA），中间的 Cas9、Cas1、Cas2等蛋白编码基因及3′端的CRISPR-Cas9位点共同组成，CRISPR序列包括间隔序列与重复序列。CRISPR-Cas9识别位点为PAM（protospacer adjacent motif），由 1～4个碱基组成[5]，一般为5′-NGG-3′结构，这类结构在几乎所有物种基因组中存在，因此CRISPR-Cas9的识别位点几乎包含所有生物，使得其在各学科中的应用受到广泛关注和诸多研究[6]。当细菌被噬菌体或病毒等外源基因侵袭时，CRISPR-Cas9将识别入侵者的PAM并找到其原间隔序列，然后把入侵者身份信息作为间隔序列记录到CRISPR序列中，当噬菌体或病毒再次入侵宿主，细菌在其前导区控制下，细菌转录重复-间隔序列转录形成pre-crRNA，pre-crRNA中的重复序列与同时被转录的tra-crRNA互补配对形成双链小向导RNA（sgRNA），在Cas9蛋白的协同下被RNaseⅢ加工处理，形成成熟的crRNA，crRNA、tracrRNA和Cas9组成复合物，识别并结合在与crRNA互补的序列上，随后DNA双链解开，形成R-loop环，之后crRNA与互补链杂交；另一条链保持单链游离形式，然后HNH活性位点剪切与crRNA互补的DNA链，RuvC活性位点剪切游离单链，Cas9蛋白引入双链断裂（DSB），随后启动2种DNA修复系统完成修复：非同源末端连接（native nonhomologous end joinijg，NHEJ）和同源重组介导的修复（homology-directed repair，HDR）[7-9]。NHEJ途径对内源基因组DNA进行敲出或替换，此途径不能进行精确控制。HDR通过引入外源DNA实现基因的精准控制。

2 CRISPR-Cas9在遗传疾病治疗方面的研究进展

2.1 CRISPR-Cas9技术对地中海贫血的基因治疗

地中海贫血是一类遗传性溶血性贫血疾病，对人类健康危害极高，也是全球最常见和发生率最高的一类单基因遗传病。地中海贫血根据基因型不同分为4种，其中α和β型较为常见。但在基因治疗方面，对β型地中海贫血（β-thalassemia，β-Thal）的研究较多。目前主要的技术思路是对β地中海贫血患者诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）通过CRISPR-Cas9技术校正血红蛋白β（hemoglobin beta，HBB）基因，从而能够分化正常红细胞，达到治愈的目的。Ou等研究[10]证实，通过CRISPR-Cas9校正β地中海贫血患者的iPSC可以避免同种异体移植排斥反应，将CRISPR-Cas9校正后的iPSC注射免疫缺陷小鼠，随后在该鼠中可看到HBB的表达，并且没有发现有恶性肿瘤。后续研究发现与已接触抗原的iPSC相比，处于分化早期的iPSC有更好的分化能力和修复能力[11-12]。Niu等[13]发现CRISPR-Cas9与单链寡脱氧核苷酸组合能够校正β地中海贫血患者iPSC中的HBB基因CD41/42突变。Luo等[14]推荐内含子序列I2-1作为HBB的校正CRISPR靶点，可提高CRISPR对iPSC校正的安全性。但如果CRISPR-Cas9识别非目标DNA序列，可导致大量非靶标断裂片段，致总染色体缺失[15]。Song[16]等报道了通过CRISPR-Cas9技术治疗β地中海贫血，首先将患者来源的皮肤细胞诱导分化为诱导性多能干细胞（β-Thal-iPSCs），再用CRISPR-Cas9技术修复血红蛋白β珠蛋白基因。结果显示，基因修正后的细胞核型正常，在向造血细胞分化的过程中，可以高比例的生成各类造血祖细胞，并表达正常的β珠蛋白。2014年，Xie[17]等也运用CRISPR/Cas9技术结合piggy Bac转座子有效地纠正患者来源的iPSCs，修复HBB基因，而且没有出现脱靶效应，细胞呈现出完整的功能性和正常的细胞核型。Ye[18]等使用CRISPR/Cas9技术在造血干细胞和祖细胞中删除13 kb的β珠蛋白基因，从而模仿自然情况下发生的遗传性胎儿血红蛋白持续存在综合征（HPFH），结果发现删除β珠蛋白位点的一部分回导致红细胞的γ珠蛋白基因表达升高，这种模拟HPFH的方法可能为β地中海贫血和镰状细胞病病人带来新的治疗前景。CRISPR/Cas9技术为地中海贫血治疗带来了希望，但是仍然面临许多困难，如经基因纠正后的HBB的分化能力、生存力和脱靶效应等安全性问题。

2.2 CRISPR-Cas9技术对杜氏肌营养不良的基因治疗

杜氏肌营养不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）是一种X染色体隐性遗传疾病，临床表现主要是因骨骼肌不断退化出现肌肉无力或萎缩，目前尚无有效疗法。该病通常由抗肌萎缩蛋白（dystrophin）基因突变引起，该基因位于染色体Xp21.2-p21.1，全长约2220 kb，包含89个外显子，cDNA全长14 kb，是目前已知最大的人类基因。DMD的突变多为1个或几个外显子的缺失导致移码突变或提前终止，不能合成正常的抗肌萎缩蛋白。目前，CRISPR-Cas9技术在杜氏肌营养不良的基因治疗领域有着较大潜力。Mendell等[19]用腺相关病毒（adenoassociated virus，AAV）载体将特定的gRNA/Cas9转入肌营养不良症模型鼠（mdx）骨骼肌和心肌中，借此敲除mdx小鼠产生自发突变的23号外显子，结果可翻译成具有部分功能的抗肌萎缩蛋白。Li[20]等用CRISPR-Cas9技术通过3种校正方法（外显子跳跃、移码和外显子敲入）校正DMD病人来源的iPS细胞，发现外显子敲入最有效，进一步通过研究基因组的完整性、核型分析、拷贝数变异和外显子测序来确定具有最小变异的克隆，最后成功检测到抗肌萎缩蛋白的表达。Long[21]等建立杜氏肌营养不良小鼠模型，用腺病毒相关病毒AAV9在mdx小鼠模型特异性表达CRISPR-Cas9，观察肌肉的结构和功能，纠正突变的抗肌萎缩蛋白基因。有研究[22]通过CRISPR-Cas9移除突变位点后，小鼠肌收缩力增加，组织学检查发现肌肉组织中坏死现象出现逆转、炎症细胞浸润减少、肌纤维化比例降低；此外，心肌细胞中的抗肌萎缩蛋白表达也有恢复。通过仅使用针对内含子区域的一个引导RNA（gRNA）来实现外显子移除，野生型肌营养不良蛋白表达得到恢复，这种技术可以提高编辑效率并减少脱靶效应的风险，因而这项研究为携带致病基因的患者开辟了新的治疗视角[23]。有研究表明，肌营养相关蛋白（utrophin）量的增加能够弥补部分抗肌萎缩蛋白的损失[24]。CRISPR-Cas9可调控基因表达，sgRNA靶标肌营养相关蛋白基因的启动子能使其编码蛋白质的量增加1.7～6.9倍，通过提高肌营养相关蛋白的表达水平来治疗该疾病。Ousterout[25]等同样也用CRISPR-Cas9技术纠正DMD患者成肌细胞中的DMD基因突变，纠正后的肌细胞能表达正常的抗肌萎缩蛋白。目前我国仍有大量杜氏肌营养不良患者，虽然该病尚无非常有效的疗法，但CRISPR-Cas9技术的迅速发展给DMD的治疗带来了曙光。

2.3 CRISPR-Cas9技术对α1抗胰蛋白酶缺乏症的基因治疗

α1抗胰蛋白酶（α1-antitrypsin，α1-AT）缺乏症是一种先天性代谢遗传疾病[26]。通过CRISPRCas9技术将α1-AT基因（AAT或SERPINA1，NC-000014.9）整合到人细胞系HEK293T的AAVS1位点，可以在细胞内表达重组α1-AT，因此，生成重组AAT蛋白是治疗α1-AT缺乏症极有希望的治疗手段，可进一步用基因编辑手段改良肝脏干细胞，治疗α1-AT 缺乏症[27]。Smith 等[28]用 CRISPRCas9技术对含有Z-AAT点突变的α1-AT缺乏患者来源的iPSC进行遗传修饰，发现能特异性靶向野生型和突变型等位基因，并能纠正基因突变位点，为α1-AT缺乏症的治疗开辟了新的思路。

2.4 CRISPR-Cas9技术对帕金森病的基因治疗

帕金森病（Parkinson′s disease，PD）是一种常见的神经系统退行性病变，其致病机理目前仍不清楚，但有研究表明遗传因素在PD发病机制中发挥重要作用。

目前药物和手术只可对症支持治疗PD，不能治愈疾病。有一种α突触核蛋白与PD发病机制密切相关，这是在中枢神经系统突触前及核周表达的可溶性蛋白质，有人提出能用CRISPR-Cas9对该蛋白进行实时监测，从而找出引发其水平异常的原因，对PD的治疗十分重要[29]。CRISPRCas9技术作为治疗遗传疾病的一种新型手段，对PD的治疗意义重大。迄今已发现至少6个易感基因与家族性PD有关，PARK16、PARK17和PARK18是PD的遗传风险基因[30]，其中PARK17的病理机制研究较少。Ishizu等[31]为了研究PARK17在体内的作用机制，构建了Vps35 D620N敲入小鼠，表达具有内源性表达模式的同源突变蛋白。同时用CRISPR-Cas9技术移除小鼠PARK17基因外显子15中的Vps35将显著降低中脑黑质多巴胺的释放，对缓解PD有一定的疗效。此外，CRISPR-Cas9可通过逐个敲除相关发病基因寻找散发性PD的基因变异[32]。

2.5 CRISPR-Cas9技术对遗传性酪氨酸血症的基因治疗

CRISPR-Cas9技术在遗传性酪氨酸血症基因治疗领域也显现出了它的优势。有研究[33]通过CRISPR-Cas9敲除小鼠羟基苯基丙酮酸氧化酶（hydroxy phenyl pyruvate oxidase，Hppd）基因的3、4号外显子，从而将Ⅰ型酪氨酸血症肝细胞转化为Ⅲ型良性酪氨酸血症，与非编辑肝细胞Fah（-/-）/Hppd（+/+）相比，基因编辑后的肝细胞Fah（-/-）/Hppd（-/-）Ⅰ型酪氨酸含量明显增长，而在部分小鼠中只出现Ⅰ型酪氨酸，在成功敲除小鼠Hppd基因的3、4号外显子后的8周内，酪氨酸分解代谢变为正常，经治疗后的小鼠健康，且无异常症状。2014年，Yin[34]等在活体成年动物体内纠正缺陷基因，治愈了遗传性Ⅰ型酪氨酸血症小鼠。他们以携带突变延胡索酰乙酰乙酸水解酶（FAH）的成年小鼠为模型，设计了3条单链引导RNA，靶向靠近突变位点的不同DNA序列，进一步将这些RNA引导链、编码Cas9的基因，以及由199个核苷酸构成、包含正常FAH基因序列的DNA模板转移至小鼠体内，采用高压尾静脉注射方式将上述CRISPR元件注入动物体内，最终进入肝细胞，1/250的肝细胞中存在正确的基因插入。转基因细胞增殖，取代病变肝细胞，最终占据约1/3肝细胞，小鼠最终生存下来。

2.6 CRISPR-Cas9技术对Crygc基因突变白内障的基因治疗

白内障是影响老年人视力及致盲的主要眼部疾病之一。2013年中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所李劲松团队将Cas9 mRNA和sgRNA-4共同注射到携带Crygc基因突变的小鼠白内障遗传疾病模型受精卵细胞质中，与对照组相比，经CRISPR-Cas9处理后的小鼠没有出现白内障，最后发现有1/3的新生小鼠白内障得到治愈[35]。白内障小鼠突变的DNA得到修复后，正常基因也随之遗传给子代，子代的白内障得到根治。这是首次将CRISPR-Cas9技术用于Crygc基因突变所致白内障领域。此后，他们还成功地在精原干细胞中利用CRISPR-Cas9技术治疗Crygc基因突变引起的白内障[36]。

2.7 CRISPR-Cas9技术对囊性纤维化的基因治疗

囊性纤维化是囊性纤维化跨膜传导调节因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）基因突变导致的细胞膜对部分离子（如Na+）的通透性降低进而造成黏液分泌过多的一种疾病。过多的黏粘液不能自由流出呼吸管，因而一再造成感染，临床表现为慢性阻塞性肺疾病，除此之外它也可能造成胰酶分泌不足，因而造成腹泻。在囊性纤维化基因治疗方面，Krishnan等[37]通过CRISPR-Cas9技术敲除CFTR基因的7号外显子后，导致Cl-释放减弱，并抑制氨基丁酸产生，降低神经兴奋，此结果提示，敲除CFTR基因可调节突触强度，且参与神经元功能的调节。Schwank等[38]用CRISPR技术以及一个包含插入修补序列的供体质粒纠正囊性纤维化患者的蛋白质错误折叠，修正后的基因表达正常，克隆类器官也获得了适当的遗传纠正，此项研究为单基因遗传缺陷患者的原代成体干细胞同源重组基因校正提供了证据。

2.8 CRISPR-Cas9技术对镰状细胞性贫血的基因治疗

镰状细胞病是在全球范围内影响人类健康和寿命的一种血红蛋白遗传性疾病。镰状细胞贫血患者D链第6位氨基酸谷氨酸被缬氨酸所代替，形成异常的血红蛋白S（HbS），取代了正常血红蛋白（HbA）。Dever[15]等发现，矫正患者的体外造血干细胞基因能治疗镰状细胞贫血。研究者获取患者造血干细胞后，用CRISPR/Cas9基因编辑系统在HBB基因的造血干细胞中实现同源重组，矫正突变的基因，然后对镰状红细胞贫血病人的造血干细胞设计一个浓缩模型，对其细胞进行浓缩，超过90%的患者实现了靶向整合，获得矫正的造血干细胞，16周后被编辑的细胞均移植入小鼠骨髓，矫正的造血干细胞仍具有造血功能，而且具有正常的红细胞寿命。Huang等[39]用CRISPR-Cas9系统对镰状细胞性贫血患者的iPSC进行基因编辑，将病人的皮肤细胞诱导成iPSC，采用同源重组来修复发生突变的HBB基因，再将修复的iPSC定向诱导分化为造血干细胞移植到病人体内，基因修正后的iPSC可以成功地分化至网织红细胞阶段，并表达正常的β珠蛋白。

2.9 CRISPR-Cas9技术对血友病的基因治疗

血友病为一组X染色体连锁遗传性凝血功能障碍的出血性疾病，表现为血浆中凝血因子合成减少或功能缺陷，凝血时间延长，轻者很轻微创伤就出血不止，重者即使不受伤也有“自发性”出血倾向。血友病分为A、B、C 3种，治疗方法有替代治疗和基因治疗[40]。血友病A（hemophilia A，HA）又称血友病甲，是由于凝血因子Ⅷ（F8）缺乏或功能缺陷引起的一种隐性遗传性出血性疾病，一般女性为携带者但不发病，男性发病，患者可出现反复的关节出血，重者脑出血，目前尚无根治方法，近年来的基因治疗给HA突变基因的修复带来了曙光。Park等[41]用HA患者的体细胞诱导产生iPSCs，然后用CRISPR-Cas9基因编辑技术对iPSCs来源的F8进行校正，校正后的iPSCs可产生表达F8基因的内皮细胞，然后把校正后的成熟内皮细胞移植到F8缺失的血友病小鼠体内，移植内皮细胞的小鼠能正常产生F8凝血因子，出血症状得到控制，HA总体上得到控制和缓解。血友病B（hemophilia B，HB）是由于凝血因子Ⅸ（F9）缺乏或血浆凝血活酶成分缺乏而引起的一种遗传病。血友病模型是基因治疗的理想模型，很多研究者采用导入外源基因的方法治疗基因疾病。Huai等[42]利用CRISPR-Cas9介导的原位基因组编辑技术构建HB小鼠模型，从小鼠尾静脉注入Cas9/sgRNA，检测到62.5%的HB小鼠中F9突变基因得到纠正，这对凝血功能不全具有有效的缓解作用。Cas9以蛋白质形式、sgRNA以RNA的3种不同形式发挥作用，将这3种形式的Cas9显微注入血友病小鼠生殖细胞，研究基因校正的效率和安全性，可知Cas9蛋白具有较高的基因恢复率、胚胎毒性小，更适合生殖细胞基因治疗。Guan等[43]在HB家族的F9基因中发现了一个新的突变位点y371d，用Cas9技术模拟y371d突变的HB小鼠模型，通过尾静脉把Cas9/sgRNA注入y371d突变的HB小鼠，超过0.56%的突变F9基因得到纠正，极大地提高了止血效率和小鼠的存活率；与此相反，腺病毒载体系统具有更高的纠正效率，但由于它有严重的肝毒性而没有治疗效果。上述研究表明，CRISPR-Cas9介导的原位基因组编辑可为人类遗传性疾病提供可行的治疗策略，但其临床有效性还须进一步研究。

3 结语

CRISPR-Cas9技术在基因遗传病治疗领域有潜在优势，科学界为CRISPR-Cas9基因治疗从概念变为现实付出了极大的努力，但目前该技术发展还存在瓶颈，在临床应用上受到一定的限制。因为CRISPR-Cas9技术实现其特异性是由PAM前后20 bp不完全匹配序列的位点决定的，因此在理论上存在产生脱靶效应（off-target effects）的可能，实际应用也印证了其脱靶概率不低的事实。另外，CRISPR-Cas9技术在不同物种间的稳定性和重复性存在较大差异。因此，有必要对CRISPR-Cas9技术进行深入研究和优化，进一步提高其临床应用的普遍性。但CRISPR-Cas9有其显著的优势，比如构建和设计方法简单快捷、对基因组的点突变编辑效率高、可同时编辑多个基因。CRISPR-Cas9以其独特的优势为遗传病、传染病、癌症等疾病提供强有力的研究和治疗手段。遗传性疾病一直是威胁人类健康的难治性疾病，从遗传疾病相关突变基因的发现，到小鼠模型的构建，再到CRISPR-Cas9治疗遗传性疾病，CRISPR-Cas9在人类遗传病基础理论研究、临床治疗等领域具有光明前景。