抗肿瘤重组麻疹病毒疫苗研制现状

李文桂，陈雅棠

重庆医科大学附属第一医院 传染病寄生虫病研究所，重庆400016

肿瘤是人类死亡的首位病因，肿瘤自身存在肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原，这些抗原可诱导机体产生免疫应答，在清除肿瘤的过程中发挥重要作用，这对于肿瘤疫苗的研制具有重要意义。现今人们报道了肿瘤细胞的死疫苗、转基因的肿瘤细胞疫苗、树突细胞疫苗、抗原合成肽疫苗和肿瘤核酸疫苗等种类，这些疫苗由于自身耐受或抗原性较低等原因，免疫效果尚不理想，因此需要研制新型肿瘤疫苗。

麻疹病毒（Measles virus，MV）是麻疹的病原体，对人体具有较强的致病性，常用麻疹病毒的减毒株进行免疫预防。已先后报道了麻疹病毒的Edmonston 减毒株、AIK-C 减毒株、Schwarzf88 减毒株、Moraten 减毒株、Connaught 减毒株、Alk-HDC减毒株、CAM-70 减毒株和Leningrad-1 减毒株等，这些减毒株常用于麻疹的免疫预防。Yanagi 等[1]发现麻疹病毒通过CD46 分子进入宿主细胞内进行繁殖，麻疹病毒感染的巨噬细胞和树突状细胞是常见的抗原递呈细胞，可以将外源抗原传递至宿主的T 细胞和B 细胞等，提示它有可能作为一种有希望的疫苗载体。Radecke 等[2]构建了穿梭表达载体pTM-MVSchw-ATU2，可将外源基因插入麻疹病毒减毒株的基因组中，这为构建重组麻疹病毒（recombinant MV，rMV）提供了有利工具。Duprex 等[3]证实麻疹病毒的减毒株可以表达绿色荧光蛋白，为构建重组麻疹病毒提供了有力证据。国外学者报道了大量抗肿瘤的重组麻疹病毒疫苗，这些肿瘤包括多形性胶质母细胞瘤、多发性骨髓瘤、前列腺癌、肾细胞癌、肝胚细胞瘤、卵巢癌、宫颈癌和乳腺癌等，我们就这方面的研制现状进行简要综述。

1 rMV抗多形性胶质母细胞瘤

多形性胶质母细胞瘤是一种颅内常见的恶性肿瘤。癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）是一种常见的肿瘤相关抗原，可作为治疗肿瘤的靶抗原之一[4]。Pheong 等[5]将CEA 基因插入MV 的N 位点，构建rMV-CEA，它可在胶质瘤细胞株中复制，引起明显的细胞毒效应。将106个U87瘤细胞颅内注射BALB/c 裸鼠，注射后4 周发现肿瘤体积大于10 mm3，此时将1.8×106PFU 重组病毒采用肿瘤内注射进行免疫治疗，每2 d 接种1次，连续接种6 次，末次免疫治疗后60 d 显示免疫组的肿瘤体积小于10 mm3，对照组为20 mm3，免疫组和对照组的存活率分别为62.5%（5/8）和25%（2/8）。

2 rMV抗多发性骨髓瘤

多发性骨髓瘤是一种播散性浆细胞恶性肿瘤。Peng 等[6,7]将1×107多发性骨髓瘤细胞ARH-77皮下注射SCID 小鼠，30 d 后静脉注射105PFU 的rMV-EGFP 或表达抗CD38 单链抗体的rMV 进行免疫治疗，每周2 次，连续7 次，末次治疗后2 周发现免疫鼠的肿瘤组织消退，体积仅为10 mm3，而对照组为200 mm3，免疫鼠的存活时间明显延长。

3 rMV抗前列腺癌

前列腺癌是男性泌尿系统常见恶性肿瘤。碘化钠同向转运体（sodium iodide symporter，NIS）是甲状腺滤泡细胞表达的膜离子通道，允许碘离子的聚集。NIS 能够富积肿瘤组织内的碘离子，可显著提高123I 的放疗效果[8]。Msaouel 等[9]将NIS蛋白的编码基因插入MV 的N 位点构建rMV-NIS，它可在前列腺癌的细胞株中生长，NIS 的表达可增加细胞内的碘离子浓度。他将5×106个LNCap瘤细胞皮下注射BALB/c 裸鼠，注射后4 周肿瘤体积为100 mm3，此时静脉注射1.5×106TCID50重组病毒进行免疫治疗，同时腹腔注射500 μCi123I 进行同位素治疗，每2 周1 次，连续7 次，末次治疗后60 d 发现免疫加同位素治疗组的肿瘤体积明显缩小，存活率为80%（8/10），而同位素治疗组的肿瘤体积继续增大，存活率仅为20%（2/10）。

4 rMV抗肾细胞癌

肾细胞癌也是泌尿系统的常见恶性肿瘤，可用重组病毒进行免疫治疗[10]。Meng 等[11]将麻疹病毒野生株的N/P/L 基因插入p（+）MV323 得p（+）MV2A，加入辅助质粒pTM（N）、pTM（L）和pTM（Pnoc）共同转染Vero 细胞株，筛选培养重组病毒，发现该重组病毒能诱导肾癌细胞株的凋亡，产生显著的细胞毒作用。他将5×106A498 瘤细胞皮下注射BALB/c 裸鼠，注射后4 周检测瘤体直径为0.5～0.6 cm，此时将1×105TCID50重组病毒采用肿瘤内注射进行免疫防治，每2 d 接种1 次，连续接种10 次，末次治疗后2 周免疫组的瘤体直径为1.8 cm，对照组为5.0 cm，免疫组和对照组的存活率分别为60%（6/10）和10%（1/10）。

5 rMV抗肝胚细胞瘤

肝胚细胞瘤是儿童易患的恶性肿瘤，可用重组麻疹病毒进行治疗[12]。Zhang 等[13]将肝胚细胞瘤的CEA 基因插入MV 的N 位点上游，构建rMVCEA，它能在肝胚细胞瘤的组织内复制，诱导瘤细胞发生凋亡，产生细胞毒效应。随后他将5×106Hep2G 瘤细胞皮下注射BALB/c 裸鼠，注射后4 周发现肿瘤直径大于0.5 cm，此时瘤体内注射1×107TCID50的重组病毒进行治疗，每2 d 进行1 次，连续6 次，治疗后80 d 发现免疫组和对照组的肿瘤直径分别为2.0 和4.5 cm，存活率分别为37.5%（3/8）和0（0/8）。

Blechacz 等[14]将5×106肝细胞癌细胞Hep-3B皮下注射SCID 鼠，注射后1 个月瘤体直径大于0.5 cm，此时静脉注射2×106TCID50的rMV-NIS，每天1 次，连续5 d 进行免疫治疗，末次免疫治疗后1 d 腹腔注射500 μCi123I 进行同位素治疗，治疗后1 h 显影成像发现治疗鼠的肿瘤组织内碘离子浓度升高，治疗组的存活时间长达41 d，而对照组仅为15 d。

6 rMV抗卵巢癌

卵巢癌是女性生殖系统的常见恶性肿瘤。Peng 等[15]将5×106卵巢癌细胞SKOV3ip.1 皮下注射裸鼠，注射后1 个月瘤体直径约0.5 cm，此时腹腔注射107PFU 的rMV-CEA 进行免疫治疗，每2 d 1次，连续16 次，末次治疗后1 d 发现小鼠血清CEA 水平较高，达300 ng/mL，末次治疗后20 d 血清CEA 水平降至基线水平，80%（8/10）治疗鼠的瘤体消退。

Galanis 等[16]将109TCID50的rMV-NIS 腹腔注射卵巢癌患者，每4 周1 次，连续6 次，末次治疗后2周发现患者外周血单核细胞中肿瘤抗原IGFBP2特异性T 细胞增加，显影成像发现肿瘤组织内NIS 表达增强，患者的生存时间延长26.5月。

7 rMV抗宫颈癌

宫颈癌是女性生殖系统的常见恶性肿瘤。大量研究发现人乳头瘤病毒16 型（Human papil⁃lomavirus type 16，HPV16）与人宫颈癌密切关联。HPV16 基因组的晚期区1 编码主要衣壳蛋白L1，该蛋白可单独组装成病毒样颗粒（VLPs），具有较强的免疫原性。Cantarella 等[17]将HPV16 的L1 基因插入p（+）MVb2 得p（+）MVb2-L1，加辅助质粒转染MRC5 细胞，筛选重组病毒，免疫印迹发现重组病毒表达的L1 蛋白可被患者血清识别。将1×105PFU 重组病毒腹腔注射IFNAR-/CD46+鼠，首次免疫后4 周加强1 次，首次免疫后6 周发现免疫鼠的血清中和抗体升高，滴度为1∶10 240～1∶40 960。

8 rMV抗乳腺癌

乳腺癌是妇女内分泌系统的常见恶性肿瘤。McDonald 等[18]将6×106乳腺癌细胞MDA-MB-231 皮下注射BALB/c 鼠，注射后4 d 静脉注射4×106TCID50的rMV-CEA，每周1 次，连续进行3 周，末次治疗后2 个月发现免疫组和对照组的肿瘤体积分别为100 和300 mm3，免疫组存活99 d，而对照组存活45 d。

中性粒细胞激活蛋白（neutrophil-activating protein，NAP）可充当 Toll 样受体2（TLR2）激动剂，促进IL-12、IFN-γ和TNF-α释放，增强Th1 应答[19]。Iankov 等[20-22]将扩增的NAP 基因插入p（+）MVeGFP 得p（+）MV-NAP，加入麻疹病毒的Schwarz 减毒株，采用共转染方式转染Vero 细胞株，筛选重组病毒，免疫印迹发现重组病毒表达的NAP 蛋白可被鼠源单抗识别。他们将1×106PFU 重组病毒采用腹腔注射接种IFN-γR-/-CD46-/-转基因鼠，发现血清IgG 水平在免疫后4～21 d 增加，21 d 达较高水平；免疫后35 d，经ELISPOT 证实脾IFN-γ+SFCs 数目明显增多；接着，将重组病毒的接种剂量减为2×105PFU，接种后18、30 和180 d 显示血清IgG 升高，滴度分别为1∶102 400、1∶512 000 和1∶409 600，接种后4 周发现血清IgG1、IgG2a 和IgG2b 水平升高，IgG1 与IgG2a 比值小于1；最后，静脉注射1×106MBA231-lu-P4 乳腺癌细胞给无胸腺裸鼠，成功制造了小鼠乳腺癌扩散模型，建模后6 d 将1×106PFU 重组病毒采用静脉注射的途径进行免疫防治，每天注射1 次，连续注射10 d，末次注射后9 d 发现治疗组的血清IL-6 水平以及胸液TFN-α、IL-6 和IL-23 水平升高，治疗组的生存时间明显长于未治疗组。

9 rMV-IL-12抗肿瘤

IL-12 可增强NK 细胞的细胞毒作用并促进LAK 和CTL 细胞生成，对肿瘤细胞具有较强的杀灭作用。Hoffman 等[23]将IL-12 的编码基因插入MV 的H-L 位点，构建重组MV-IL-12。将3×104PFU 疫苗肌肉注射恒河猴，免疫后7 d 发现免疫猴的外周血单核细胞可明显增殖，可产生高水平的IL-10、低水平的IFN-γ和IL-12；血清IgG 在免疫后14～45 d 升高，免疫后21 d 达较高水平；抗体亚类分析表明IgG1 升高，免疫后21 d 达较高水平。rMV-IL-12 抗瘤试验正在进行中。

10 结语

重组麻疹病毒疫苗作为一种新型疫苗具有下述优点：自1970年开始接种麻疹病毒的减毒株以来，已有上千亿儿童进行接种，安全有效，接种1 或2 次即可诱导终身免疫，接种费用较低；麻疹病毒仅在宿主细胞的胞浆内复制，排除了整合入宿主染色体的可能性；麻疹病毒的编码蛋白较少，可以避免不必要的免疫应答；重组麻疹病毒的遗传稳定性强，可替代常规麻疹病毒疫苗的标准株进行免疫接种；运用基因剪切等手段改造靶抗原基因，可使重组麻疹病毒日趋完美；尚未发现重组麻疹病毒可在宿主体内永久性存在或扩散现象；麻疹病毒减毒株的接种网点多，价廉物美，大量生产非常容易。

该疫苗尚存在以下缺陷：外源基因的表达需特殊载体；表达蛋白的水平较低；表达产物可能对疫苗有害；由于缺乏蛋白修饰系统，不能高效合成真核蛋白；表达产物与天然蛋白存在一定差异等。

要想将重组麻疹病毒发展成为一种理想疫苗，尚须弄清下述问题：高效启动子和增强子的开发利用；加入理想的分子伴侣，使外源蛋白的分泌达到较高水平；选择合适的信号肽序列促进蛋白前体的正确折叠和表达；如何消除重组麻疹病毒所含的抗生素抗性基因对人体或环境的损害；口服多价重组重组麻疹病毒的研制开发；如何选择重组麻疹病毒的新选择标志；深入研究重组麻疹病毒的保护性机制。阐明这些问题，有助于提高人们对重组麻疹病毒防治肿瘤的信心。