CFW荧光染色法在甲真菌病诊断中的应用研究

岳学苹 石秀艳 陈伟 万喆 李若瑜 王爱平 李清

(1.首都医科大学附属北京天坛医院皮肤性病科，北京 100050；2.北京大学第一医院皮肤性病科 北京大学真菌和真菌病研究中心，北京 100034)

甲真菌病 (onychomycosis)是由皮肤癣菌、酵母菌和其他霉菌所致的甲疾病。流行率[1]在欧洲、东亚、北美分别达到23%、20%和14%。传统的诊断方法包括10%KOH (potassium hydroxide)溶液湿片法镜检和真菌培养。KOH法[2-5]虽然快速、经济、高效，阳性率也较高，但镜下视野难以辨别真菌和角质细胞，且查找费时，对技术员的技术水平要求较高。真菌培养虽然特异性高，且可以鉴定菌种，但阳性率较低。其他检查方法包括甲碎片或病甲活检组织的PAS染色[2,6]、PCR[3]和荧光染色[7-9]等。但PAS和PCR在临床的普及率更低。荧光染色法非常简单快速，常用的荧光试剂为CFW (Calcofluor white)，以往报道多应用于真菌性角膜炎[10-11]的诊断，阳性率较高。个别报道将其应用在甲真菌病的诊断中[7-8]，且该方法目前已逐步在临床推广应用。本研究采用新开发上市的CFW荧光试剂，通过与KOH法、真菌培养对比，探讨CFW荧光染色法在诊断甲真菌病方面是否有优越性，并比较其镜下特点。

1 材料和方法

1.1 标本来源

选择2016年3月1日～7月1日就诊于北京天坛医院和北京大学第一医院皮肤科门诊的拟诊为甲真菌病的患者。本实验获得北京天坛医院伦理委员会批准，实验前患者签署知情同意书。

1.2 主要试剂和仪器

CFW荧光液 (立特晰，合肥华今生物科技有限公司，主要成分KOH+CFW+Evens blue)。荧光显微镜 (Olympus，CX23LEDRFSIC，340～360 nm紫外光源，普通光源)。ImageAnalysis软件。

1.3 方法

病甲先拍照，同一病甲同时取3份甲下或甲表面碎屑，分别进行KOH湿片法、真菌培养、CFW荧光染色法检测真菌。并记录KOH法和CFW法的制片时间和第一次找到真菌的时间。进行CFW染色时，碎屑放置在载玻片上，滴1滴CFW荧光液，0.5 min后盖上盖玻片，必要时滤去多余染液，用酒精灯加热数秒，然后应用荧光光源观察。对同一患者CFW染色下，同一视野分别在荧光和普通光源下拍照，比较CFW和KOH镜下的特点和区别。

1.4 数据处理与统计学分析

通过SPSS V21 (IBM SPSS Statistics,USA)软件统计三种方法的真菌检测阳性率，应用McNemar检验分别比较CFW和KOH、CFW和培养的阳性率。另外，以KOH法作为金标准，计算CFW法的敏感性、特异性，阳性预测值 (positive predictive value,PPV)和阴性预测值 (negative predictive value,NPV)。

2 结 果

入组100例临床拟诊的甲真菌病患者共100例病甲标本，男56例，女44例；年龄3～86岁；指甲26例，趾甲74例。100例样本中，3种方法中至少有一种阳性的69例。每一种检查方法的阳性率分别为CFW 64% (64/100)，KOH 63% (63/100)，培养31% (31/100)(见图1)。三种方法全部阳性29% (29/100)，全部阴性31% (31/100)。KOH阳性而CFW阴性5例，反之，KOH阴性而CFW阳性6例。CFW法与KOH法的阳性率比较差异无统计学意义 (P>0.05)，CFW与真菌培养阳性率比较差异有统计学意义 (P<0.01)。以KOH法为金标准，计算得出CFW的敏感性、特异性、PPV和NPV分别为92.06%、83.78%、90.3%和86.11%。

在制片时间上，KOH法为2.5 min，最先观察到菌丝时间上为1～5 min。CFW法分别为0.5 min和1～2 min。CFW法显微镜下所见菌丝呈蓝色，背景角质细胞淡染，二者对比明显，但由于很多菌丝位于不同平面，镜下成像清晰度一般。KOH法镜下菌丝呈高折光性，平行排列。颜色上与背景的角质细胞很难区分，镜下成像清晰度更差。图2显示了CFW染色下同一显微镜视野不同光源的结果。二者均可观察到长短不等的菌丝，分隔、分支明显，或笔直或缠绕或折叠或呈串珠状排列。部分可以观察到假菌丝和孢子，但CFW法紫外光源下观察到的菌丝或孢子明显比KOH下清晰，容易辨认。

3 讨 论

甲真菌病常用的诊断方法包括KOH湿片法真菌镜检和真菌培养。以往文献的报道[2-5]显示在韩国、希腊、伊朗、阿根廷对临床怀疑甲真菌病的患者KOH镜检的阳性率分别为55.9% (93例)、15.1% (418例)、56.4% (140例)和61% (5 961例)；真菌培养的阳性率分别为29.4%、10.5%、25%和45.3%。本研究显示KOH和培养的阳性率分别为63%和31%，这一结果与文献报道结果类似[2，4,8]，培养结果略低于文献报道[5]。

本研究在这两种检测方法之外，增加了CFW荧光染色法，阳性率为63%，与KOH法类似，但与培养比较差异有统计学意义，这一结果与文献报道结果类似[7-8]。Bonifaz等[7]比较了KOH、培养和CFW的阳性率分别为66.67%、33.33%和57.58%。Weinberg等[8]评估了应用KOH、真菌培养、PAS和CFW共4种方法检测105个怀疑甲真菌病患者的阳性率，结果显示，共93例至少一种方法阳性，分别为KOH 60%、PAS 74%、CFW 72%、培养48%。

图1拟诊甲真菌病患者3种不同诊断方法的阳性率和阴性率图23个甲真菌病患者 (A，B，C)CFW染色下同一显微镜视野在普通光源 (A1，B1，C1)和紫外光源 (A2，B2，C2)下菌丝的对比结果。显示CFW下紫外光源下的菌丝或孢子明显比普通光源下更清晰、容易识别 (A,B.×200;C.×400)

Fig.1Positive and negative results of three different diagnostic methods in patients with suspected onychomycosisFig.2The microscopic images of the same field under normal light (A1,B1,C1) and ultraviolet light (A2,B2,C2) in CFW stain with three different onychomycosis (A,B,C).The hyphae and spores were more clear and obvious in ultraviolet light (A,B.×200; C.×400)

本研究以KOH法为金标准，计算得出CFW法的敏感性、特异性、PPV和NPV分别为92.06%、83.78%、90.3%和86.11%。Haldane等[12]报道CFW法在浅表真菌感染中的敏感性为92%、特异性95%、PPV 74%、NPV 99%，与我们的结果类似。但Haldane等以培养为金标准，在培养阳性病例中，确定CFW的敏感性和特异性，而我们以KOH法为金标准，二者计算方法不同。

本研究的结果显示，从制片时间上，CFW染色需0.5 min，KOH法需要2.5 min左右。而识别真菌效率上，CFW法大多在1～2 min能迅速找到真菌，KOH却需要1～5 min。因此CFW染色法简单、方便、快速，镜下容易快速识别真菌。以往的CFW荧光染色法报道中，Gupta等[9]需要15～20 min；Bonifaz等[7]应用CFW时需要先后滴加多种溶媒、固定、静置10 min才能检测；Zhang等[11]滴KOH，盖盖玻片后，需要在边缘滴加1滴CFW，用滤纸从另一边缘吸引染料，并静置2 min后观察。这些都增加了制片时间，且操作的便捷性较差。本研究的荧光试剂同时混合了KOH+CFW+EB，染色0.5 min后即可观察。相比上述方法大大缩短制片时间。镜下观察时，即使KOH对角质细胞溶解不佳，由于CFW对真菌细胞壁结构的高度敏感性和结合特异性，也可迅速准确地找到真菌，且真菌与角质细胞很容易区分；而KOH下真菌与角质细胞颜色接近，有时溶解欠佳时，很难区分。CFW染色下同一视野不同光源下的结果，也证明了CFW下的真菌比KOH下更清楚，更易识别，大大加速了真菌的识别速度。所以，CFW法可以明显提高真菌识别率，缩短制片和诊断时间，不易漏诊，这是CFW染色法的最大优势。

因此，本研究中，尽管CFW荧光染色法与KOH湿片法相比并未明显提高诊断阳性率，但CFW荧光染色法仍是一种制片简单、方便、快速，真菌识别率高的诊断方法，可以提高实验室的诊断准确性和效率。

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