急性脑梗死患者循环miR-124表达水平与脑梗死体积、神经功能缺损程度的关系及其诊断价值

冯锦丽　王卫

脑卒中是全球脑死率和严重长期残疾的主要原因之一，预计到2030年将增加24.9%[1]。由于其多个潜在危险因素引起的疾病的复杂性阻碍了该疾病的诊断和潜在的治疗。在过去几十年中影像学检查如CT、MRI都有助于脑卒中的早期诊断及治疗。脑梗死的早期准确诊断对于临床治疗至关重要，并将大大改善预后。然而，与心肌梗死等疾病相比，脑梗死的早期诊断和预后评估常常受到极大的限制[2]。已有部分研究将一些生物标志物如C-反应蛋白(CRP)、白细胞介素-6(IL-6)、基质金属蛋白酶(MMPs)等作为辅助诊断脑梗死的工具，但其特异性以及区分ACI及其相关危险因素的能力有很大的局限性[3]。目前仍然缺乏ACI诊断及预后评估的敏感的生物标志物，有关ACI诊断和预后评估的指标需要进一步的研究。

随着基因芯片技术鉴定RNA生物标志物的方法的出现，可以对细胞、组织或血液中提取的RNA针对特定的基因表达进行定量的检测。基因表达的变化反映在脑梗死患者外周血RNA中。通过血液mRNA基因表达谱可以区分短暂性脑缺血发作(TIA)，进一步了解TIA原因，脑卒中风险和其他TIA病理生理学信息[4]。血液mRNA基因表达谱可作为脑卒中的基因组生物标志物，甚至是作为脑卒中亚型的特征[5-6]。

miRNA是一类22个核苷酸，短的非编码RNA分子，通过与靶向mRNA的3'非翻译区(UTR)互补结合来调节各种生物过程。除了细胞间分布外，miRNA在所有类型的体液中普遍存在。由于其组织特异性、相对稳定性和体液丰度，miRNA被认为是组织损伤的敏感的血浆生物标志物[7]。miRNA是脑的发育和功能的重要调节因子，miRNA的变化与脑卒中发生的高危因素、神经元死亡、炎症反应、血脑屏障破坏和脑水肿形成等有关[8]。脑梗死后脑组织和血液中表现出特异性的miRNA表达[9]。此外，循环miRNA表达在脑卒中患者以及不同脑卒中亚型中差异很大，因此循环miRNA表现出发展成缺血性脑卒中生物标志物的潜力[10]。

作为特异性的脑miRNA，miR-124是成人和胚胎脑中最丰富的miRNA。然而，miR-124在脑缺血中的确切机制未知。近年来的研究发现，大鼠血浆miR-124在脑缺血后6 h显著升高，中脑动脉闭塞建模后48h仍保持高水平，表明其作为脑梗死的生物标志物的潜在作用[11]。本研究旨在观察ACI患者 miR-124水平的变化，并对循环miR-124水平的变化与脑梗死体积、NIHSS评分之间的关系进行分析，为miR-124在脑卒中的潜在应用价值提供了一定的参考依据。

1　资料与方法

1.1一般资料选取2015年4月～2016年12月在本科住院的ACI患者90例，其中男57例，女33例，年龄 47～78岁，平均年龄(58.9±10.3)岁。纳入标准：①符合1995年全国第四届脑血管病学术会议修订的缺血性脑卒中的诊断标准[12]，并经头颅CT、MRI扫描证实；②首次发病，发病72h内入院；③经医院伦理委员会同意，患者及家属签署知情同意书。排除标准：①近期有感染、发热、脑外伤等疾病患者；②短暂性脑缺血发作或合并脑出血、蛛网膜下腔出血等疾病；③有恶性肿瘤、严重心肝肾疾病、血液系统等疾病患者。另选取同时期体检健康者40例作为对照组，其中男23例，女17例，年龄40～63岁，平均年龄(56.3±9.4)岁。2组年龄、性别及体质指数(BMI)比较无明显差异(P>0.05)，具有可比性。

表1　2组受试者一般资料比较

1.2方法

1.2.1分组根据发病后3～7 d的头部CT计算脑梗死体积，按Pullicino等[13]公式:梗死体积(cm3)=π/6×长×宽×CT扫描阳性层数，根据脑梗死体积将ACI患者分为3个亚组：小梗死组(<5 cm3，n=38)，中梗死组(5～10 cm3，n=31)，大梗死组(>10 cm3，n=21)；根据美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分，将ACI患者分为3个亚组：轻度组(≤6分，n=30)、中度组(7～14分，n=34)、重度组(≥15分，n=26)。

1.2.2循环miR-124表达水平检测患者于住院次日，体检健康者于体检当日晨起空腹采集静脉血，加入到乙二胺四乙酸(EDTA)处理的抗凝血管中，3000 r/min离心10 min后分离血浆，然后再以12000 r/min离心10 min分离血浆，置于无RNA酶的Ep管中，置于-80 ℃冰箱保存，集中待测。操作步骤为①RNA提取：按照mirVana PARIS试剂盒说明书(ABI公司，美国)分离总RNA。通过用RNase Free水洗涤，收集总RNA(100 μL)，然后使用NanoDrop ND-1000核酸定量检测仪检测RNA浓度和纯度(NanoDrop公司，美国)；②qRT-PCR：逆转录引物为miR-124，5'-GTCGTATCCAGTGC-AGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGA-CGGCATT-3'；U6，5'-AAAATATGGAACGCTTCACGAATTTG-3'。按照TaqMan microRNA逆转录试剂盒说明书(Ambion公司，美国)进行逆转录，定量检测血浆样品中microRNA。用于PCR的引物设计为miR-124，前向5'-GCTAAGGCACGCGGTG-3'，反向5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；U6，正向5'-CTCGCTTCGGCAG CACATATACT-3'，反向5'-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3'。qPCR在7300实时PCR系统(美国应用生物系统公司)上进行。U6snRNA用于标准化miRNA的表达。Ct值是指样品管的荧光信号达到某一固定阈值的PCR反应循环周期数。采用2-ΔΔCT方法计算miR-124的相对表达水平。

2　结　果

2.1各组循环miR-124的表达水平比较观察组miR-124相对表达水平(2.93±1.21)明显高于对照组(1.09±0.55)(t=10.198，P<0.01)。

2.2不同脑梗死体积组miR-124的表达水平比较不同脑梗死体积3个亚组间miR-124相对表达水平比较有明显差异(F=20.963，P<0.01)。进一步两两比较发现，小梗死组miR-124相对表达水平明显高于中、大梗死组(P均<0.01)，中梗死组miR-124相对表达水平明显高于大梗死组(P<0.01)(图1)。相关性分析显示，miR-124相对表达水平与脑梗死体积呈负相关(r=-0.577，P<0.01)(图2)。

图1　不同梗死体积组miR⁃124相对表达水平比较

图2　miR⁃124表达水平与脑梗死体积的相关性分析

2.3不同NIHSS评分组患者miR-124的表达水平比较不同NIHSS评分3个亚组间miR-124相对表达水平比较无明显差异(F=1.170，P>0.05)(图3)。

图3　不同NIHSS评分组miR⁃124相对表达水平比较

3　讨　论

脑卒中是一种威胁人类健康和生命的重大脑血管病，发病率、残疾率和病死率均较高。急性脑缺血可能引发一系列瀑布式病理生理学级联反应包括炎症反应、氧化应激、自由基损伤、神经元凋亡等，最终导致不可逆转缺血区神经元死亡。本研究旨在找到有效的生物标志物用于早期诊断缺血性脑卒中，对于及时有效的治疗和改善预后具有重要意义。已有研究认为，脑特异性miR-124可作为脑组织损伤诊断敏感性的循环生物标志物[7]。

miR-124是在除垂体腺以外的所有脑区域中高度特异性表达的miRNA，参与干细胞调节和神经发育[14-15]。miR-124在各种细胞和组织类型中显示特定的时间和空间分布，并影响中枢神经系统中广泛的生物学功能。Hamzei等[16]研究表明在大脑中脑动脉闭塞小鼠模型中外源性给予miR-124可以起到保护神经和抗炎作用，减少神经元凋亡，miR-124可作为脑卒中发作时神经保护和功能恢复的新型治疗策略。Laterza等[7]研究发现制作脑梗死大鼠模型后8 h大鼠血浆miR-124表达水平升高，产生脑损伤，24 h达到峰值。Weng等[11]研究发现脑梗死大鼠模型中血浆miR-124表达水平在6 h显著升高，48 h后仍然保持高水平，表明血浆miR-124可以作为候选生物标志物用于脑梗死的早期检测。在动物模型中miR-124已经被提出作为缺血性脑损伤的标志物。本研究发现，ACI患者循环miR-124相对表达水平较对照组显著升高。本研究推测，miR-124从梗死的脑组织中释放入血，可能在脑缺血中起到重要的保护作用。miR-124在体内缺血应激反应中显著升高，可能是一种保护性反应。

miR-124在脑缺血中的作用尚不明确，可能具有多重和复杂的作用。Sun等[17]研究显示，与大脑中脑动脉闭塞小鼠的非缺血区相比，缺血半暗带区miR-124表达水平显著增加，而敲除miR-124显著增加了小鼠的梗死面积。在体外miR-124促进了抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl的表达，从而有效减少神经元凋亡，这说明miR-124通过凋亡抑制途径在缺血性脑卒中发挥神经元保护作用。Doeppner等[18]研究显示病毒载体介导的miR-124可减少脑损伤和功能障碍，增强神经血管重塑。miR-124通过RE1沉默转录因子(REST)降解在缺血条件下促进神经元存活。因此，异位miR-124表达作为脑卒中治疗中一个新颖的思路。然而，也有报道miR-124对于脑卒中治疗不相一致的结果。Zhu等[19]研究显示敲除大脑miR-124可以减少神经元死亡和梗死面积，减轻脑组织损伤。另外，Liu等[20]研究发现尽管miR-124模拟物在局部脑缺血24 h后不影响脑梗死体积，但是由于iASPP表达上调，miR-124的抑制有效地减轻了缺血性脑损伤。miR-124在缺血性脑卒中的机制仍有待于进一步的阐明。

目前血浆miR-124与ACI患者脑梗死面积、神经功能缺损严重程度之间的关系尚无一致的结论。Ji等[21]对血清外来体miR-124在急性缺血性脑卒中(AIS)诊断和损伤评估的价值进行了研究，结果发现与对照组相比，AIS患者血清外来体miR-124的中值水平明显升高，与NIHSS评分、梗死体积和IL-6血清浓度均呈正相关，外来体miR-124的AUC值为0.6976。这表明miR-124可能是诊断AIS和评估由缺血性脑损伤引起的神经功能脑损伤程度的潜在生物标志物。Liu等[22]研究发现血清miR-124在急性缺血性脑卒中发生后24h内显著降低，miR-124水平与ACI患者梗死体积和血浆高敏C反应蛋白水平呈负相关。这表明血清miR-124在急性缺血性脑卒中被抑制，从而促进神经炎症和脑损伤。本研究为了评估脑梗死急性期miR-124的诊断价值，分析了miR-124表达水平与梗死体积和NIHSS评分的关系，结果显示ACI患者梗死体积越大，miR-124相对表达水平越低，miR-124水平与脑梗死体积存在显著负相关，这与之前Liu的研究报道[23]相一致，而miR-124水平与NIHSS 评分无明显关系。

由于miR-124在缺血性脑卒中的复杂性，除了ACI患者自身遗传、社会特征外，样本量大小、单个中心研究甚至取样时间的不同等因素都有可能影响研究结果。这就需要扩大样本量、多中心研究来进一步验证研究结果。本研究不足之处在于未能对miR-124在ACI发病过程中表达水平的变化进行系统的观察，以期了解治疗前后循环miR-124水平的变化以及对于预后评估的价值。此外，未来的研究工作还将对miR-124与炎症因子之间的关系做进一步研究分析，了解miR-124在缺血性脑卒中中抗炎/促炎的角色。

综上所述，在脑梗死急性期循环miR-124表达水平明显增高，且其与脑梗死体积大小密切相关。

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