小檗碱对三转基因阿尔茨海默病小鼠的学习记忆和海马PSD95突触相关蛋白表达水平的影响

常鑫　梁宇彬　车思璇　黄敏　曾思琳　陈思言　郭毅

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种隐匿性起病的神经变性疾病，患者主要表现以近期记忆力下降，伴有行为障碍和认知障碍，后期还可以表现为精神行为异常[1]。AD以神经纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFTs )由过度磷酸化的不可溶性Tau蛋白形成以及神经炎性淀粉样蛋白沉积形成的老年斑(senile plaque，SP )为主要两大病因学说，其中还有神经凋亡学说、神经突触丢失、氧化应激学说等[2]。突触后致密蛋白95[3](postsynaptic denisty protein 95，PSD95)是神经元的突触核心蛋白，记忆的保存与形成有赖于突触蛋白结构完整性和可塑性。目前治疗仍未发现治疗AD的有效药物，因此研发治疗AD的有效药物是亟待解决的问题。小檗碱[4](Berberine，BBR)是黄连素一类的生物类碱，BBR具有多种的药理作用效果，包括明显的抗炎作用、抗病毒、抑菌及降糖、降脂等作用。一些研究表明BBR能改善AD的症状并减轻其病理学表现[5]。因此，本实验采用新型的三转基因(3×Tg)小鼠作为AD的动物模型，选择8月龄的3×Tg-AD小鼠以进一步探讨BBR对海马PSD95表达水平的影响及与微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)自噬水平、磷酸化蛋白激酶B(phos-phorylated protein kinase B,p-Akt)和磷酸化雷帕霉素靶蛋白[phosphorylated manmmalian target of sirolimus(Rapamycin)，p-mTOR]信号通路的关系，探索小檗碱改善AD的临床症状并分析其作用机制。

1　材料与方法

1.1实验对象30只雄性的三转基因AD小鼠购自美国Jax动物实验室，它能稳定性表达人源突变基因APPswe、TauP30IL以及鼠源突变基因的PS1M146V，体重(30.32±2.50)g，在标准条件下饲养。该8月龄的三转基因AD小鼠具有认知功能下降、老年斑沉积、神经突触丢失等特征。

1.2实验相关试剂、材料小檗碱购自武汉福鑫化工有限公司；即用型免疫组织化学试剂盒购自深圳赛百科生物技术有限公司；蔗糖、多聚甲醛、戊二醛、盐酸、磷酸二氢钠、氯化钠、磷酸氢二钠、水合氯醛、甲醇、乙醇、盐酸、PBS等均购自深圳生物化学试剂公司；一抗：PSD95、GAPDH购自美国Abcam公司，p-Akt(Ser473)、p-mTOR(Ser2448)以及Akt、mTOR、微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)购自CST公司。二抗：兔抗鼠DL488荧光二抗购自南京森贝伽生物有限公司，鼠二抗、鼠二抗购自美国Abcam公司。

1.3方法

1.3.1分组及给药处理将30只雄性8月龄的三转基因AD小鼠随机分为3组，即AD对照组、AD+20 mgBBR组和AD+50 mgBBR组，每组各10只，给药剂量方式分别为小檗碱25 mg·kg-1·d-1、小檗碱50 mg·kg-1·d-1，AD对照组给予等容量生理盐水灌胃，连续干预3个月。

1.3.2行为学检测小檗碱灌胃3月后对各组AD小鼠进行Morris水迷宫行为学测试。Morris水迷宫实验分为定位航行及空间探索两部分。其中定位航行经历5 d，空间探索为2 d。定位航行第1 d为试练期：把小鼠置于平台停留10 s，随后把小鼠从4个不同象限的对应位置面壁放入池内，小鼠登上平台且停留2 s后终止记录，最长记录时间为60 s，若AD小鼠在60 s内仍不能上台，将其引致平台停留10 s，以便适应平台；上述行为学检测循环4个象限，训练定位航行；定位航行第2～5 d为检测期。空间探索实验：在第7 d将平台撤走并把各组的三转基因AD小鼠从一处放入水中，同时观察60 s内小鼠通过原平台位置次数和在原平台所在象限的停留时间百分比[6]。通过水迷宫跟踪系统得出数据，利用Graphpad Prism 5软件进行数据整理作图分析。

1.3.3免疫荧光实验测试PSD95阳性表达水平将培养7 d后的各组原代细胞培养基移去，将PBS洗涤3次后将40 g/L多聚甲醛放置培养皿上固定1 h，梯度乙醇脱水，二甲苯透明、浸蜡、包埋、切片、43 ℃水浴展片、捞片、37 ℃烘箱烤片，脱蜡，采用SABC方法进行免疫组化染色。将PSD95(1∶400比例)抗体稀释作为一抗， 二抗室温孵育1 h，荧光抗淬灭封片剂封片，激光扫描共聚焦显微镜观察，以镜下观察PSD95阳性表达水平。

1.3.4Western blotting检测各蛋白表达水平小檗碱药物处理3个月后各组取4只小鼠断头取脑，在无菌条件下在显微镜下剥离血管膜和取出完整的海马组织放入无菌EP管中，按照质量比例加入蛋白提取试剂盒。超声破碎组织、离心，取上清即为可溶性蛋白(TBS-soluble),分装冻存至-80 ℃冰箱；采用BCA法对样品进行蛋白定量，SDS-PAGE凝胶电泳分离后转印到PVDF膜上；80 mV电泳120 h，5%脱脂奶粉封闭2 h，加PSD95(1∶3000)、LC3-Ⅱ(1∶3000)、p-Akt(1∶5000)、p-mTOR(1∶5000)，4 ℃过夜；TBST 漂洗次3 次；加入1:5000兔二抗、鼠二抗室温孵育2 h；TBST 漂洗3 次，10 min/次；ECL发光液显影。利用Quantity One凝胶定量软件进行吸光度值分析，利用Prism5软件作图片分析。

2　结　果

2.1检测行为学的实验Morris水迷宫试验显示AD+25 mgBBR和AD+50 mgBBR组的逃避潜伏期较AD对照组均减少(P<0.05，P<0.01)，而50 mgBBR组的每天逃避潜伏期较AD+25 mgBBR组较减少(P<0.05)；同时各组小鼠的游泳速度没有明显差异(P>0.05)。空间探索：AD+25 mgBBR组和AD+50 mgBBR组的所在象限停留时间及跨越原平台的次数较AD对照组均增加(P<0.05,P<0.01)，且AD+50 mgBBR组更为明显(图1)。

2.2免疫荧光检测PSD95阳性表达水平AD+25 mgBBR组和AD+50 mgBBR组的三转基因小鼠海马组织中CA1区的免疫阳性反应呈绿色荧光散点，AD+25mgBBR组呈细小点状连接成片，个别细胞有散在绿色荧光包围，AD+50 mgBBR组的绿色荧光颗粒染色较多、较深，多个细胞有绿色荧光包围；AD对照组三转基因小鼠海马组织中CA1区的免疫阳性反应呈浅绿色，散在细点、稀疏(图2)。

图1　A为各组小鼠逃避潜伏期、游泳速度；B为各组小鼠通过平台的次数、原平台所停留的时间百分比(%)；与AD对照组∗P<0．05，∗∗P<0．01，#P<0．05(n=10)

图2　PSD95在各组小鼠海马组织CA1区的表达情况(DAB×400倍与AD对照组比较，∗∗P<0．01，n=4)

2.3Western blotting实验与AD对照组比较,AD+25 mgBBR组和AD+50 mgBBR组的PSD95突触蛋白水平均升高(P<0.01)(图3)；AD+25 mgBBR组和AD+50 mgBBR组的自噬水平LC3-Ⅱ较AD对照组升高(P<0.05)(图3)；AD+25 mgBBR组和AD+50 mgBBR组的p-Akt、p-mTOR的表达水平较AD对照组均明显升高(P<0.05)(图3)。

3　讨　论

本实验选取可过表达人源突变基因APP/Tau/PS1的三转基因AD小鼠可较好地作为AD病理模型。该三转基因AD小鼠[7]从4月龄渐开始出现AD的初期病理表现如老年斑Aβ的沉积、tau蛋白过度磷酸化、神经异常凋亡、神经突触丢失及突触结构的破坏，该8月龄AD小鼠逐渐表现出学习记忆受损、易激怒等行为学上的改变。小檗碱[8]是一种天然的生物碱，有抗炎、抗凋亡、降脂等多种药理作用。最近研究表明小檗碱能改善AD的病理如减少老年斑Aβ沉积、减少tua蛋白过度磷酸化等，目前作为神经退行性疾病的预防用药备受关注。本实验予小檗碱两种不同的剂量，分别是25 mg、50 mg干预该8月龄的三转基因AD小鼠，Morris水迷宫行为学检测提示小檗碱组的逃避潜伏期及停留原平台所占的时间较AD对照组均缩短，提示小檗碱能改善三转基因AD小鼠的学习记忆、空间探索能力。

突触后致密蛋白(PSD)[9]是特定的突触连接细胞骨架，是突触后信号转导机制的重要组成部分；PSD95是PSD基本结构蛋白，分子量为95kDa，能在N-甲基D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR)和突触膜表面蛋白之间起诱导作用，对神经突触传来的兴奋性信号转导能快速进行整合[10]。PSD95能增强突触可塑性、突触的完整性，且在学习记忆过程中起关键作用。对抑制PSD95表达的小鼠会出现学习记忆能力障碍、突触数量丢失及完整性缺失[11]。本实验发现三转基因AD小鼠给予小檗碱干预后其脑部的海马组织中PSD95蛋白表达水平增高，同时能增强其学习记忆、空间探索能力。

LC3-Ⅱ是自噬过程中产生的自噬膜结构，是反映自噬水平主要标志物[12]，自噬主要是清除异常蛋白物质(如Aβ)、过度磷酸化纤维缠结及受损细胞器的过程，在AD病程中发现自噬水平却呈下降趋势，而病理的Aβ沉积毒性、神经纤维缠结的沉积加重了AD病理进程；本实验提示小檗碱干预后的三转基因AD小鼠脑部海马的LC3-Ⅱ水平呈升高趋势，提示小檗碱能升高其自噬水平，提高清除、吞噬Aβ、受损细胞器等异常物质的能力。有研究还表明通过自噬水平[13]诱导激活雷帕霉素和Akt/mTOR信号能抵抗淀粉样蛋白-β沉积及抗氧化应激，保护神经突触(PSD95)可塑性、增加其神经传递功能。mTOR是负责转录、翻译生长因子、胰岛素整合及脑源性营养因子的蛋白合成[14]，Akt[15]信号是其上游因子，促进mTOR信号激活，增加PSD95等蛋白表达。mTOR[16]还具有营养神经因子的作用，营养神经因子的起始通路是Akt/mTOR，本实验通过小檗碱干预AD小鼠后使Akt/mTOR信号通路表达增加，提示小檗碱具有营养神经因子的作用，同时上调mTOR表达水平能增加PSD95的表达[17]，同时能保护神经突触的完整性、提高其可塑性。

图3　各组小鼠WB检测　1为AD对照组；2为AD+25mgBBR组；3为AD+50mgBBR组(n=4)；A为各组小鼠的PSD95表达水平；B为各组小鼠的自噬LC3⁃Ⅱ水平；C为各组小鼠的p⁃Akt、p⁃mTOR蛋白表达水平；与AD对照组比较，∗P<0．05，∗∗P<0．01

综上所述，应用50 mg剂量的小檗碱能有效改善三转基因AD小鼠的学习记忆、空间探索能力，增加突触后致密蛋白PSD95表达，其可能机制是小檗

碱通过增加自噬水平来上调Akt/mTOR信号通路保护神经元突触的可塑性、结构的完整性，但调控突触蛋白表达的具体机制仍需进一步探索。

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