牛副流感3型NP融合蛋白原核表达及间接ELISA检测方法的建立

王苗苗，张玲玲，张 峣，冉旭华，闻晓波

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江 大庆 163319）

牛副流感病毒3型（Bovine parainfluenza virus type 3，BPIV3）为副黏病毒科、呼吸道病毒属成员，与牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）、牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）、牛呼吸道合胞体病毒（Bovine respiratory syncytial virus，BRSV）共同构成了引发牛呼吸道疾病综合征（Bovine respiratory disease complex，BRDC）的主要病毒性病原，常导致持续性感染，是目前引发反刍动物急性呼吸道疾病的主要病原，也是引起世界范围内的舍饲牛发病及死亡的主要原因之一，对世界养牛业造成的经济损失较大[1-4]。自1959年Reisinger等首次从犊牛肾脏中分离到BPIV3，之后世界上许多国家也相继报道分离出BPIV3，目前该病毒已呈现世界性广泛分布的趋势[5-10]。我国于2008年由刘鹏等在黑龙江省分离出该病毒[11]，此后在多地也分离到该病毒[3，12]。经血清学调查表明，养牛业发达的地区感染该病毒情况较重，已在我国广泛性分布[13]。

BPIV3具有核衣壳结构和囊膜[14]，与仙台病毒等其他副粘病毒相似。目前为止，已发现BPIV3有A、B、C 3种基因型[15]。编码M蛋白、磷蛋白P、F蛋白、N蛋白、NP蛋白、L蛋白及D、V、C 3种非结构蛋白[14，16]。NP蛋白为BPIV3的核衣壳蛋白，保守性较高[16]，因此本研究拟选取NP基因构建融合蛋白表达载体，建立间接ELISA方法来检测BPIV3抗体水平，为牛副流感3型提供高效便捷的检测方法。

1 材料和方法

1.1 质粒、菌种、病毒、血清 原核表达质粒pET-28a、 菌 株 E.coli BL21（DE3）及 E.coli DH5α、BPIV3c NX49分离株、BPIV3阳性血清及阴性血清、BVDV阳性血清、BHV-I阳性血清均由黑龙江八一农垦大学预防实验室保存。

1.2 主要试剂 TRIzol、Ni-NTA Purification System（ 美 国 Invitrogen）； RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit、蛋白质Marker、限制性内切酶Nde I、BamH I、Sac I、HindⅢ（美国Thermo Fisher Scientific）； Wizard®SV Gel and PCR Clean-Up System、GoTaq® Green Master Mix（美国Promega）；辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗牛IgG（Sigma）；PrimeSTARTMHS DNA Poymerase及DNA Marker（日本TaKaRa）；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 抗原表位区域的筛选 利用DNASTAR中Protean程序对NX49株NP基因进行抗原表位分析，所选区域命名为 NP-N（8～156 aa）及 NP-C（368～507 aa）并设计2对特异性引物进行扩增，引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。引物序列如表1所示。

表 1 引物序列Table 1 Sequences of primer

1.4 目的基因的扩增及纯化 参照TRIzol使用说明书提取BPIV3 RNA，参照Thermo反转录试剂盒说明书进行反转录获得cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，并以ddH2O为阴性对照，反应体系如下：5×PrimeSTAR®Buffer 10 μL，dNTPs 5 μL，Prime-STAR®HS 0.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 3 μL，补加ddH2O至50 μL。PCR反应条件：98℃预变性3 min；98℃变性10 s，60℃退火10 s，72℃延伸1 min，共35个循环；72℃最终延伸10 min，PCR产物以1%琼脂糖凝胶进行电泳，并通过Wizard®SV Gel and PCR Clean-Up System试剂盒进行回收纯化。

1.5 重组质粒ppEETT--2288aa--NNPP--NN--CC的构建 将NP-N纯化产物及载体pET-28a分别经NdeI、BamH I双酶切，回收并纯化酶切产物，以T4 DNA连接酶16℃连接12 h，将连接产物转化至感受态E.coli DH5α，于37℃培养12 h，挑取单菌落接种至2 mL含35 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中培养，以NP-N-F/R、NP-C-F/R、T7 Promoter/Terminator为引物对重组菌进行鉴定，以ddH2O为阴性对照。通过碱裂解法提取重组菌质粒，并以NdeI、BamH I双酶切做进一步鉴定。将NP-C纯化产物与重组质粒pET-28a-NP-N分别经SacI、HindⅢ双酶切，以T4 DNA连接酶连接、转化、鉴定方法同上。将鉴定正确的重组菌送往北京六合华大基因科技股份有限公司测序，将测序正确的重组质粒命名为pET-28a-NP-N-C。

1.6 重组蛋白的诱导表达及可溶性分析 将重组质粒pET-28a-NP-N-C及空载体pET-28a分别转化至E.coliBL21（DE3）感受态中，并将重组菌1%转接至含有35 μg/mL的LB培养液中，37℃培养至对数生长期，加入终浓度为1 mM的IPTG，诱导4 h，收集菌体并以PBS洗涤，Bug Baster®Master Mix裂解菌体，分别收集裂解后上清及沉淀，经SDS-PAGE电泳分析重组蛋白的表达形式。

1.7 重组蛋白的纯化及鉴定 收集2 L诱导表达后的重组菌，超声裂解菌体，转化至E.coliBL21（DE3）感受态中收集裂解沉淀，采用Ni-NTA Purification System纯化重组蛋白，具体方法参照说明书，对纯化后的目的蛋白进行复性处理。重组蛋白以SDS-PAGE电泳后，转膜并以脱脂乳封闭，加入BPIV3阳性血清（1:80倍稀释），4℃孵育过夜。加入HRP标记的兔抗牛IgG（1:5 000倍稀释），37℃孵育1 h。加入DAB显色3 min，以ddH2O终止反应。

1.8 间接EELLIISSAA方法的优化 将融合蛋白NP-N-C以CBS倍比稀释至0.5～8 μg/mL，包被ELISA板，100 μL/孔。对BPIV3阴、阳性血清也分别倍比稀释至1:40～1:320，采用棋盘滴定试验，确定最佳抗原包被浓度及血清最佳稀释度。设置4℃包被过夜，37℃包被1 h，37℃包被2 h，37℃包被1 h后4℃过夜，共4组不同的包被条件，确定抗原最佳包被条件。分别以2.5%、5%、10%3个浓度脱脂乳作为封闭液，37℃封闭，封闭时间设置为30、60、90和120 min，对封闭液最佳浓度及时间进行优化。分别以1:3 000、1:5 000、1:7 000 3个不同的稀释度对HRP标记的兔抗牛IgG进行稀释，37℃孵育，孵育时间设置为30、45和60 min，对二抗最佳稀释倍数及孵育时间进行优化。以TMB显色液显色，显色时间分别设置为5、10、15和20 min，对显色时间进行优化。测定阳性血清、阴性血清的OD450并计算P/N值，以P/N值最大且阳性血清OD450≥1.0、阴性血清OD450＜0.2作为间接ELISA优化条件的判定标准。

1.9 阴、阳性临界值的确立 随机选取85份BPIV3阳性血清及79份BPIV3阴性血清，以已建立的ELISA方法分别进行检测，测定OD450值。将测得的OD450值进行统计学分析。通过非参数法构建ROC曲线，以Youden指数最大的切点作为阴阳性判断的临界点，并确定该方法的特异性及敏感性。

1.10 重复性试验 取一块同批次包被的酶标板，用其检测4份不同效价的阳性血清和2份阴性血清，每份血清做3个平行重复，以ELISA方法筛选出的最优条件来对稀释后血清进行检测，统计学分析OD450并计算批内重复试验变异系数，统计学分析试验结果。

用不同时间抗原包被的ELISA板，对4份不同效价的阳性血清和2份阴性血清进行3次批间重复检测，以ELISA筛选出的最优条件来对稀释后血清进行检测，统计学分析OD450并计算批间重复试验变异系数，评价该方法的批间重复性。

2 结果

2.1 目的基因NNPP--NN及NNPP--CC的扩增 PCR扩增目的基因NP-N及NP-C，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，得到447 bp及420 bp 2条特异性条带，与预期片段大小（如图1）。

2.2 原核表达重组质粒的鉴定 菌液PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，扩增出片段大小为447 bp（NPN）、420 bp（NP-C）、1 146 bp（NP-N-C）的特异性条带，与预期相符（如图2）。测序结果表明，重组质粒中的目的基因与NX49株基因组序列素编码的核苷酸、氨基酸的同源性均为100%，可用于原核表达。

2.3 重组蛋白的诱导表达形式的鉴定 诱导表达产物裂解后上清及沉淀经Glycine-SDS-PAGE分析，得到大小为42 kDa的条带，与预期大小相符（如图3），并以包涵体的形式表达。同时于约35 kDa处出现一条带，需进一步鉴定。

2.4 重组蛋白的纯化 重组蛋白经Ni-NTA系统纯化后于42 kDa及35 kDa位置均出现条带(如图4)。纯化的重组蛋白浓度约为123 μg/mL。

2.5 重组蛋白的Western BBlloott鉴定 以BPIV3 NX49株为阳性对照，Western Blot结果表明重组蛋白在42 kDa及35 kDa处条带均能与BPIV3阳性血清发生特异性反应，全病毒蛋白对照组也在42 kDa及35 kDa位置处出现了2条特异性条带（如图5），说明表达的目的蛋白以2种形式存在，而且均具有良好的反应活性。

图 1 NP基因片段的RT-PCR扩增Fig.1 Amplifiation ofNPfragment by PCR

图 2 目的基因的扩增Fig.2 Amplifiation of target genes

M：蛋白Marker；1：对照组诱导后裂解上清；2：对照组诱导后裂解沉淀；3：重组菌诱导后裂解上清；4：重组菌诱导后裂解沉淀

图 4 纯化后重组蛋白的Glycine-SDS-PAGE分析Fig.4 The Glycine-SDS-PAGE of purified recombinant protein

2.6 间接EELLSSIIAA方法反应条件的优化结果 对BPIV3间接ELISA反应条件的优化结果见表2。

2.7 间接EELLIISSAA临界值的确定 通过对随机选取的85份BPIV3阳性血清及79份BPIV3阴性血清检测，统计学分析OD450值，得到特异性与敏感性相关的ROC曲线（如图6），本研究中Youden指数最大为0.927，所对应的临界值为0.267，此时该方法的特异性为97.4%，灵敏性为95.3%。

M：蛋白质；1：对照组诱导后裂解沉淀与BPIV3阳性血清的反应；2：重组蛋白与BPIV3阳性血清的反应；3：NX49株与BPIV3阳性血清的反应

2.8 重复性试验 通过对4份阳性血清及2份阴性血清进行的同批次及不同批次的重复性试验，分析统计试验结果，结果见表3，分别计算OD450平均值、标准差、变异系数，结果显示批内批间重复性试验变异系数均小于10%，证明了该间接ELISA方法重复性较好。

图 6 ROC曲线Fig.6 Receiver-operator characteristic curve

表 2 间接ELISA方法反应条件的优化Table 2 The optimized coditions of indirect ELISA

表 3 重复性试验结果Table 3 The result of repeatability test

2.9 临床样品的检测 对279份来自不同地区的血清采用本试验建立的间接ELSIA方法进行检测，检出BPIV3阳性血清223份，阴性血清56份，血清BPIV3抗体阳性率为79.9%，如表4所示。

表 4 BPIV3抗体血清学调查Table 4 Serological survey of antibodies against BPIV3 in 3 provinces of China

3 讨论

BPIV3等病毒引起的BRDC发病率较高，常与其他病原体混合感染或继发感染，临床诊断较难，危害舍饲牛的健康，严重影响养牛业的经济效益，而我国针对BPIV3的检测方法的研究尚不成熟，尚无商品化的检测试剂盒[17-19]。在养牛业的发达国家，BPIV3的感染率及抗体阳性率同样处于较高水平。有研究指出20世纪80年代，墨西哥及阿根廷的BPIV3阳性率分别为85.6%和77.3%，欧美的健康牛血清中BPIV3普遍存在抗体[20-21]。澳洲仅出口牛中BPIV3的感染率及抗体阳性率达到了46%和87%[22]。国内也进行了一些BPIV3感染的流行病学调查，我国BPIV3血清阳性抗体率高达77.96%，感染率与抗体阳性率在逐渐增加[23]。因此建立针对BPIV3的诊断技术对BPIV3防控至关重要。

ELISA方法具有检测快速、操作便捷等特点，适用于流行病学调查及牛场大规模检测时的血清检测。传统的间接ELISA检测方法一般以全病毒或病毒的某个蛋白作为包被抗原，全病毒抗原难以纯化且成本较高。本研究选取NP基因中的抗原表位区域构建了pET-28a-NP-N-C原核表达载体，转化至E.coli BL21（DE3）感受态中，以纯化的重组蛋白作为抗原与待检BPIV3抗体相结合，建立的间接ELISA方法重复性好、特异性强和敏感性高，可用于BPIV3抗体的检测，为BPIV3检测试剂盒的开发铺设了条件。

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