猪瘟病毒NS4B真核表达载体的构建与表达

王小柱

（辽宁省畜产品安全监察所，辽宁 沈阳 110003）

猪瘟（swine fever，CSF），也称猪霍乱，是由猪瘟病毒（CSFV）引起的一种猪急性、接触性传染病，死亡率高达90%。该病以高热和出血为主要临床表现，以小血管壁变性、内脏器官多发性出血、梗塞和坏死等为主要病理特征[1]，对养猪业的危害极大，造成严重的经济损失[2-3]。目前，我国CSF在发病及流行特点上出现了新变化，表现为隐性感染范围广，发病无典型症状，免疫猪群免疫后抗体水平低，免疫失败时有发生，成为当前我国猪瘟防制中的一大难题。基于此，很多学者认为其流行现状与CSFV遗传变异有关，因此很有必要进行CSFV流行毒株的序列测定与分析，了解CSFV流行毒株的基因变异情况[4-6]。

猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）是猪瘟的病原体，长4O～6O nm，为有囊膜的单股正链RNA病毒，属黄病毒科瘟病毒属。基因组全长约12.5 kb，仅有一个开放性阅读框架（ORF）[4-8]。NS4B是古典猪瘟病毒的一种非结构蛋白，是一种严重的高致命性疾病病原体。NS4B基因位于基因组偏3’端部分，它在病毒生命周期中的功能尚不清楚。NS4B基因在瘟病毒中较保守，在猪瘟病毒各毒株间有较高的同源性[9-12]。将NS4B基因插入质粒载体pEGFP-N3，构建携带NS4B基因的重组真核表达载体，为进一步研究NS4B基因的功能以及猪瘟病毒的致病机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种与载体 大肠杆菌DH5α感受态细胞、猪瘟病毒S株、pMD18-T载体、pEGFP-N3质粒。

1.1.2 培养基 LB液体培养基。

1.1.3 试剂 引物、E×Taq DNA聚合酶、琼脂糖，DNA marker、溴化乙锭（EB）检测液。Biospin胶回收试剂盒、TIANpure Midi Plasmid Kit，购自天根生物公司。Ligmix Kit，HindⅢ、BamHⅠ，T4 DNA连接酶购自Takara公司。

1.1.4 仪器 PTC-200型PCR仪（MJ Research公司）、电子天平（型号：ALC-210.3）、松下微波炉（型号：NN-G3641MF）、电泳仪（Bio-Rad公司）、DYY-Ⅲ40B型电泳槽（北京六一仪厂）、离心机5804R（Eppendorf公司）。

1.2 方法与步骤

1.2.1 设计引物 从GenBank中查找猪瘟病毒NS4B基因序列，由MEGA 4.0分析软件对序列进行分析，阅读其框架，根据引物设计原则设计1对引物，在上游引物5'端引入HindⅢ酶切位点和翻译起始密码子ATG；在下游引物5'端引入BamHⅠ的酶切位点和翻译终止密码子TCA，上下游引物5’端加保护碱基（GC）[12]。引物由北京华大基因科技有限公司合成。

NS4B（1 041 bp） 无HindⅢ（AAGCTT）和BamHⅠ（GGATTC）

上游引物：5’ GC AAGCTT ATG gctcagggggatgtgcag 3’

下游引物：5’ GC GGATTC TCA tagctggcggatctttcc 3’

1.2.2 PCR产物处理 引物稀释后进行PCR反应，退火温度为55℃，45 s；延伸温度为72℃，1 min。循环数为33。随后进行电泳PCR产物（90 V，30 min）的切胶回收并与T载体16℃连接过夜。

1.2.3 转化到感受态DH5α 取20 μL连接产物加到含100 μL E.coli感受态细胞的Ep管中，混匀，冰置30 min；42℃热击（水浴锅）90 s，冰置2 min；加入800 μL的LB液体培养基，放在37℃水浴100 min涂平板。37℃倒置培养后选5个单菌落，挑半个菌落，进行菌落PCR检测，100 μL PCR体系与之前相同，分装成5管，每管20 μL（模板为菌落），选条带较清晰的菌落，挑剩下的半个菌落，在20 mL的LB液体培养基中振荡过夜（12～16 h）。提取重组质粒。后扩增提取质粒载体pEGFP-N3。

1.2.4 测序 检测与T载体连接的NS4B基因是否突变。测序结果说明基因未突变，可继续试验。测序由北京华大基因科技有限公司完成。

1.2.5 转化小提 pMD18-T-NS4B重组质粒和质粒载体pEGFP-N3，将酶切后的产物并切胶回收目的片段并将酶切后的NS4B基因与质粒载体pEGFP-N3连接。转化感受态DH5α涂平板，在LB固体培养基含Kan，37℃进行选择性培养。后挑取单克隆扩增。提取pEGFP-N3-NS4B重组质粒并酶切检测。

1.2.6 质粒转染表达 将该质粒转染293T细胞，并用Western Blot检测蛋白表达。

2 结果

对最后提取的重组质粒进行酶切检测，获得NS4B基因片段，表明猪瘟病毒NS4B真核表达载体构建成功。

2.1 各操作过程检测结果 DNAmarker电泳条带由负极到正极为：2 000、1 000、750、500、250和100 bp。NS4B基因长度1 041 bp，pMD18-T载体长度2 960 bp，pEGFP-N3质粒长度4 700 bp。

2.2 00NNSS 44 BB与PPmmdd1188--TT重组载体测序结果 NS4B-pMD18-T质粒测序，基因在T载体上的插入位点425，T载体上的序列做引物。引物M13-F（347～370）、M13-R（478～500）经比对测序峰图，重组载体构建正确。

图 1 PCR扩增目的基因电泳图Fig.1 Electrophoretic picture of target gene amplified by PCR

图 2 含有pMD18-T-NS4B重组质粒的菌落PCR电泳结果Fig.2 Electrophoretic picture of Colony PCR with pMD18-T-NS4B plasmid.

图 3 pMD18-T-NS4B重组质粒酶切鉴定Fig.3 Enzyme digestion of pMD18-T-NS4B recombinant plasmid

图 4 pEGFP-N3-NS4B重组质粒酶切结果Fig.4 Enzyme digestion of pEGFP-N3-NS4B recombinant plasmid

2.3 Western BBlloott检测蛋白表达

图 5 Western Blot检测NS4B蛋白表达Fig.5 Detection of NS4B protein expression by Western Blot

3 讨论

猪瘟病毒NS4B基因的研究表明，NS4B可能与病毒致病性有关，具体功能尚不清楚。本试验以猪瘟病毒S株NS4B基因为研究对象，以其与pMC18质粒连接成的重组质粒为模板，克隆NS4B基因，再将其与质粒载体pEGFP-N3质粒载构建真核表达载体，为进一步研究NS4B基因的功能提供前提[13-14]。

在试验中首先进行了PCR扩增，切胶回收目的片段后与T载体连接，转化，提取的重组质粒酶切后，切胶回收目的基因，再与pEGFP-N3质粒连接，转化后，选择性培养基上长出菌落，挑单菌落进行菌落PCR检测，对阳性菌落进行摇菌培养，提取的重组质粒，进行酶切检测，结果表明猪瘟病毒NS4B真核表达载体构建成功。

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