Lipofectamine2000降低 HeLa细胞系中DNMT1的表达

赵 丹，程易尘，吴晓明，罗 瑛，贾舒婷

(昆明理工大学 医学院，云南 昆明 650500)

DNA甲基化是一种非常重要的表观遗传修饰，在基因的表达调控、基因组的稳定性和发育过程中都发挥着重要的作用[1]。DNA甲基化的维持由DNA甲基化转移酶家族成员DNA甲基转移酶1(DNMT1)催化完成。DNA甲基化水平的改变，通常与DNMT1密切相关[3- 4]。而Lipofectamine2000是一种常用的阳离子脂质体转染试剂，广泛地应用于特定基因的表达和敲低对细胞影响的研究。而阳离子脂质体对细胞有一定的毒性作用[5]。转染试剂Lipofectamine2000会影响细胞中DNMT1的表达，Lipofectamine2000对细胞的毒性作用可能是通过DNMT1实现的。因此本研究通对DNMT1在Lipofectamine2000处理Hela和395- 9B- 1(小鼠胚胎成纤维细胞)细胞不同时间后的表达情况进行检测，并探讨Lipofectamine2000对细胞的毒性作用。

1 材料与方法

1.1 材料:HeLa细胞、395- 9B- 1细胞、胎牛血清和胰蛋白酶(Amresco公司)；DMEM (Life Technologies公司)；Lipofectamine2000(Invitrogen公司)；5Aza(5-氮杂-2’-脱氧胞苷，Sigma公司)；DNMT1和beta-actin抗体(Santa Cruz公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及处理:将细胞置于10%胎牛血清的DMEM培养基中,37 ℃、5% CO2培养箱中培养HeLa和395- 9B- 1细胞，细胞覆盖率为90%时传代，达到70%～80%用Lipo2000处理。具体步骤为：将20 μL Lipofectamine2000加入3 mL OPti-DMEM培养基中室温孵育25 min。吸除细胞培养液并用PBS清洗。将上述混合液加入培养皿中，置于培养箱中培养。6 h后更换DMEM培养基终止处理，分别于处理后24、48及72 h和7 d收集细胞沉淀， -80 ℃保存备用。5Aza处理细胞作为阳性对照。

1.2.2 RT-RCR检测DNMT1的mRNA表达:收集细胞沉淀后，用Trizol提取总RNA，以Oligo-d(T)引物GoScriptTMReverse Transcription System试剂盒(Promega公司)进行反转录得到CDNA。实验方法参照产品说明书。引物序列，DNMT1 正向引物5′-CCGTGGCTACGAGGAGAAC-3′，反向引物5′-TTGGGTTTCCGTTTAGTGGGG-3′；beta-actin正向引物5′-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，反向引物5′-CAATAGTG ATGACCTGGCCGT-3′。

1.2.3 检测DNMT1蛋白表达:取适量上述细胞沉淀提取蛋白，每孔加入15 μg蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白(电泳条件：恒压140 V 1.5 h)。再用300 V、180 mA湿转3.5 h至硝酸纤维素膜上，然后用5%脱脂奶粉室温封闭1 h。再加入相应一抗室温反应3 h，用TBST缓冲液洗涤3次，每次5 min，后加入相应二抗，室温反应2 h，用TBST洗涤6次，每次5 min。最后用显影液处理1 min后用全自动洗片机进行显影后的成像。

2 结果

2.1 Lipofectamine2000处理影响HeLa细胞的状态:Lipofectamine2000处理后24 h细胞变长，至72 h这一现象更加明显，并且细胞外膜有向外延伸的状态，而7 d后细胞形状基本恢复到原先状态(图1)。

2.2 HeLa细胞中DNMT1的mRNA表达量:Lipofectamine2000处理HeLa细胞48 h后，DNMT1 mRNA降低；处理后7 d，DNMT1 mRNA明显升高(图2)。

2.3 Lipofectamine2000处理影响HeLa细胞中DNMT1蛋白的表达:经Lipofectamine2000处理HeLa细胞48 h后DNMT1蛋白水平的表达显著降低，72 h后有回升的趋势(图3)。

2.4 Lipo2000处理影响395- 9B- 1细胞中DNMT1的表达:用Lipo2000处理395- 9B- 1细胞后5 d，细胞中DNMT1蛋白有持续升高的趋势(图4)。

图1 HeLa细胞形态图Fig 1 The morphology of HeLa cells

*P<0.05 compared with control图2 HeLa细胞中DNMT1的mRNA表达水平Fig 2 mRNA expression level of DNMT1 in HeLa

图4 395- 9B- 1细胞中DNMT1蛋白表达变化Fig 4 The protein expression of DNMT1 in 395- 9B- 1 cells

A.Western blot results; B.quantitative chart of Western blot;*P<0.05 compared with control；△P<0.05 compared with 48 hours

3 讨论

HeLa细胞是实验中最常用的一种人源模式细胞，广泛的应用于各种研究。Lipofectamine2000对细胞是有一定毒性的，而其具体的原因目前还不是很清楚。本研究发现这一毒性在Hela细胞中可能是通过对DNMT1蛋白水平的短期抑制改变细胞的表观遗传修饰来实现。小鼠胚胎成纤维细胞的实验结果表明，Lipofectamine2000对细胞DNNT1表达的影响可能具有普遍性，为Lipofectamine2000的细胞毒性研究提供一个新的视角。

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