熊果酸对肝纤维化大鼠NOX2/ROS/NLRP3炎性小体活化的影响

黄晨恺，甘达凯，张 望，罗方云，陈 江，汪安江，李弼民*，朱 萱*

(1.南昌大学第一附属医院 消化内科；2.江西省消化研究所, 江西 南昌 330006)

核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族吡啉结构域蛋白3(NOD-like receptor family pyrin domain containing 3，NLRP3)炎性小体与肝纤维化相关[1]。NADPH氧化酶(NADPH oxidase，NOX)产生的活性氧簇(ROS)作为NLRP3炎性小体活化的重要因素之一，参与了肝纤维化的发生发展[2]。熊果酸(ursolic acid，UA)是从药用植物中提炼出的一种天然三萜类化合物，具有抗菌、抗病毒和保护肝损伤等药理活性。本课题组前期体外实验证实，UA能抑制肝脏中TGF-β的表达，下调HSC-T6细胞中的NOX各亚基的表达，抑制NOX活性，进而下调下游促纤维化信号通路，减少I型胶原的产生[3- 4]。但UA是否通过抑制肝脏NOX2/ROS/NLRP3炎性小体活化而减少肝内胶原沉积尚无文献报道。因此，本文将进一步探讨UA减少肝内胶原沉积是否与其抑制肝脏NOX2/ROS/NLRP3炎性小体活化有关。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂：熊果酸(ursolic acid，UA，Sigma公司)；蛋白提取试剂盒(贝博生物有限公司)；ALT检测试剂盒和ROS检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)； mRNA引物(上海捷瑞生物工程有限公司)；天狼星红(Sirius-Red)染色试剂盒(北京索莱宝生物科技有限公司)；总RNA提取试剂盒、cDNA第一链合成试剂盒、荧光定量PCR试剂盒(Tiangen公司)； 兔抗鼠NLRP3多克隆抗体(CST公司)；兔抗鼠NOX2多克隆抗体(Abcam公司)、兔抗鼠caspase- 1多克隆抗体(Abcam公司)；兔抗鼠caspase- 1 p10多克隆抗体、兔抗鼠IL- 1β多克隆抗体(Santa-cruz公司)；小鼠抗大鼠β-actin单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(中杉金桥有限公司)。

1.1.2 实验动物：SPF级雄性纯系8周龄SD大鼠18只，体质量250～300 g[莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK(湘)2013- 0004]。将大鼠饲养于适宜环境中，自由采食和饮水。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分组与处理：分为对照组(CON，n=6，2 mL/kg橄榄油灌胃8周，结束后继续给予0.9%氯化钠溶液灌胃4周)，肝纤维化组(CCl4，n=6，2 mL/kg 20% CCl4灌胃8周，每周2次，结束后继续给予0.9%氯化钠溶液灌胃4周)[5]及熊果酸治疗组(UA-T，n=6，完成肝纤维化造模后每天用40 mg/kg剂量熊果酸混悬液灌胃4周)。各组药物处理结束72 h后，用真空采血管留取门脉血待用；取下肝脏，留取新鲜肝脏组织待用，将其余组织固定于10%甲醛固定液中，常规脱水包埋。

1.2.2 大鼠血清谷丙转氨酶(ALT)的测定：按试剂盒说明书步骤操作，设置测定管与对照管，使用分光光度计在波长505 nm处测定各管吸光度(A)值。绝对(A)值=测定管(A)值-对照管(A)值。查标准曲线，求得各组样本血清中谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)含量(U/L)。

1.2.3 HE及天狼星红染色：控制切片厚度为6 μm，常规脱蜡。将切片进行HE染色，中性树胶封固，显微镜下观察，采用Ishak肝纤维化评分系统[6]对切片进行评分；天狼星红染色液滴染1 h。流水冲洗。Mayer苏木精染色液染细胞核8 min。流水冲洗10 min。常规脱水透明，中性树胶封固。显微镜下观察肝内胶原沉积。

1.2.4 RT-qPCR检测Nox2、Nlrp3、caspase- 1及IL- 1β mRNA表达：分别取肝纤维化组及对照组小鼠的肝组织100 mg用吸附柱法提取肝组织总RNA，琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性，并用分光法测定RNA 含量。用反转录试剂盒将RNA 反转录成cDNA。随后以cDNA为模板进行qPCR反应。步骤严格按说明书操作。每个样本设3个复孔，以每个组织样本各指标的循环数计作Ct值，最终以2-ΔΔCt值评估相对表达量。引物序列见表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Gene primer sequence for RT-qPCR

1.2.5 Western blot检测NOX2、NLRP3、caspase- 1、及IL- 1β蛋白表达：提取肝脏组织总蛋白后采用8% SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，条件为浓缩胶60 V、1 h，分离胶100 V、2 h。电泳完成后将凝胶中的蛋白通过湿法电转移方法转移到硝酸纤维素(NC)膜上；将NC膜于5%脱脂奶粉中室温封闭1 h。将NC膜分别与抗NOX2 (1∶1 000)、抗NLRP3 (1∶1 000)、抗caspase- 1 p10(1∶1 000)和p45(1∶400)及抗IL- 1β(1∶200)多抗稀释液或抗β-actin单抗(1∶1 000)稀释液4 ℃孵育过夜。次晨将膜取出，用TBST洗膜3次，每次5 min。洗膜结束后与辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG稀释液(1∶2 000)4 ℃孵育4 h，化学发光显色系统显色。用Image lab分析系统进行曝光及灰度值扫描，将每组所测的蛋白条带吸光度值分别与相对应的β-actin的吸光度值相比较，计算出两者的吸光度值比。

1.2.6 免疫组化检测NLRP3、caspase- 1及IL- 1β蛋白表达：切片常规脱蜡、水化，对各组肝脏组织切片进行预处理，柠檬酸盐热修复；运用3% H2O2阻断内源性过氧化物酶，孵育8 min；分别滴加兔抗鼠NLRP3、caspase- 1或IL- 1β多抗，4 ℃孵育过夜；滴加山羊抗兔IgG 37 ℃孵育30 min；在显微镜下进行DAB显色，控制反应；双蒸水冲洗终止反应；漂洗，复染，封片。在胞质内发现黄、棕色颗粒判定为阳性细胞。每组任取6张切片，每张切片任意选取5个视野，将结果输入image-proplus软件，如阳性细胞少于5%，记0分；5%～25%，记1分；26%～50%，记2分；51%～75%，记3分；大于75%，记4分[7]。

1.2.7 肝脏组织中ROS的测定：取新鲜肝脏组织300 mg配制蛋白上清液；按10 nmol/L DCFH-DA∶PBS=1∶9的比例配制成1 mmol/L DCFH-DA工作液，加入配制好的蛋白上清液，用等量PBS溶液设置对照孔。移液枪吸打混匀，37 ℃孵育30 min，激发波长485 nm，发射波长525 nm，测定其荧光强度。测定结果以荧光强度/毫克蛋白表示。ROS(荧光强度/毫克蛋白)= 荧光强度/(蛋白浓度×0.19)。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 UA对肝纤维化大鼠ALT的影响

CCl4模型组血清ALT含量显著高于对照组(P<0.05)；UA治疗组血清ALT含量明显低于CCl4模型组(P<0.05)(表2)。

表2 各组大鼠血清ALT含量Table 2 Serum ALT analysis of each n=6)

*P<0.05 compared with control group；#P<0.05 compared with CCl4group.

2.2 UA对肝纤维化大鼠肝脏病理形态及胶原沉积的影响

与对照组相比，CCl4模型组肝脏内有纤维间隔形成，胶原沉积明显；与CCl4模型组相比，UA治疗组肝脏内纤维间隔明显减少，Ishak’s肝纤维化评分降低，胶原沉积减轻(P<0.05)(图1，2)。

2.3 UA对肝纤维化大鼠NOX2及NLRP3炎性小体mRNA表达的影响

CCl4模型组，Nox2、Nlrp3、caspase1和IL- 1β mRNA表达均较对照组明显上升(P<0.05)；UA治疗组Nox2、Nlrp3、caspase1和IL- 1β mRNA表达量均较CCl4模型组显著下降(P<0.01)(图3)。

2.4 UA对肝纤维化大鼠NOX2/NLRP3炎性小体活化的影响

各组WB吸光度值比较见图4A。CCl4模型组肝组织内NOX2蛋白的含量显著高于对照组(P<0.01)，UA治疗组NOX2的表达量出现明显下降(P<0.01)(图4B)；CCl4模型组NLRP3(P<0.01)及caspase- 1 p10(P<0.05)亚基的表达出现显著上升；UA治疗组两者的表达均较模型组显著下降(P<0.05)(图4C，D)； CCl4模型组的IL- 1β蛋白表达量也较正常组也出现显著上升(P<0.01)(图4F)。各组caspase- 1 P45结果并无差异(P>0.05)(图4E)。各组肝脏免疫组化结果显示，UA治疗组NLRP3、caspase- 1及IL- 1β的表达均较CCl4模型组减少(P<0.05)(图5)。

HE (×100) and sirius-red staining (×200) were used to analysis the liver pathological characteristics and the collagen deposition in liver tissues, respectively

图1肝组织HE及天狼星红染色
Fig1HEandsirius-redstainingoflivertissues

*P<0.05 compared with CCl4 model group图2 各组大鼠肝纤维化Ishak评分Fig 2 Ishak’s fibrosis score of each group

*P<0.05 compared with control group;#P<0.01 compared with CCl4model group

图3肝组织中Nox2、Nlrp3、caspase-1及
IL-1βmRNA的表达

A-F are Western blot of NOX2, NLRP3, caspase- 1 (p10 & p45), and IL- 1β protein levels;*P<0.05,**P<0.01 compared with control group；#P<0.05,##P<0.01 compared with CCl4model group

NLRP3 & IL- 1β were identified(×200); caspase- 1 was identified(×400)图5 免疫组化检测各组肝组织中NLRP3、caspase- 1及IL- 1β的表达Fig 5 Immunohistochemistry analysis of NLRP3, caspase- 1 and IL- 1β expression in each group

2.5 UA对肝纤维化大鼠肝组织中ROS的影响

CCl4模型组大鼠肝组织中ROS的水平显著高于对照组(P<0.05)；而与CCl4模型组相比，UA治疗组中ROS水平显著减少(P<0.05)(图6)。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with CCl4 model group图6 各组新鲜肝组织内ROS的荧光强度Fig 6 ROS fluorescence intensity of liver tissue

3 讨论

UA对肝脏损伤有保护作用，但具体机制尚未阐明[8]。早期肝纤维化过程中细胞外基质过度沉积是肝纤维化的标志之一，主要表现为肝内纤维间隔的产生和胶原沉积[9]。本课题组大量前期研究发现熊果酸可以抑制肝星状细胞中JAK2/STAT3[10]、PI3K/Akt[3]及ERK1/2信号通路[11]，激活蛋白1(AP- 1)和核因子-κB(NF-κB)的表达而抑制HSC活化。本次体内实验中，肝纤维化大鼠血清ALT水平显著上升，肝内有大量纤维间隔产生，Ishak纤维化评分升高，胶原沉积明显增多。在给予UA灌胃后肝纤维化大鼠血清ALT水平显著降低，肝内纤维间及胶原沉积得到明显改善，Ishak纤维化

评分下降。说明UA可以保护肝细胞，抑制肝内胶原沉积，改善肝纤维化。

NOX2/ROS/NLRP3炎性小体活化是肺纤维化发生发展过程中重要的信号通路之一[12]，在肝纤维化中的作用尚未阐明。NLRP3炎性小体是一种NLRP3、CARD区域的凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein，包括CARD，ASC)及半胱天冬酶1前体(pro-caspase- 1)组合而成的蛋白质复合体[13]。NOX2通过DAMP途径产生的ROS是导致NLRP3炎性小体活化的重要因子之一[14]。当胞内NLRP3受到胞内ROS刺激后会使无活性的caspase- 1前体(pro-caspase- 1)活化为有活性的caspase- 1，而caspase- 1可以将无活性IL- 1β前体(pro-IL- 1β)及IL- 18前体(pro-IL- 18)剪切为IL- 1β及IL- 18并释放到胞外，从而引发下游炎性效应[15]。实验显示，UA可以抑制NOX2产生的ROS，使下游NLRP3炎性小体中caspase- 1活化及释放受限，导致IL- 1β成熟及释放减少。这说明UA很可能通过NOX2/ROS/NLRP3炎性小体活化信号通路改善肝内胶原沉积。另一方面，在RT-qPCR实验中，肝脏内Nox2、Nlrp3、Il- 1β的mRNA水平与蛋白印记结果一致，但UA治疗组caspase1的mRNA水平被显著抑制，而caspase- 1 p45亚基(pro-caspase- 1)的蛋白印记结果各组间对比后并无统计学差异(图4E)。据此推测，UA不只在mRNA水平抑制caspase1的转录翻译过程，可能是在蛋白质水平抑制NLRP3炎性小体中caspase- 1的成熟活化过程。但这仍需要进一步验证。

综上所述，UA能发挥肝脏保护作用，改善肝纤维化，其机制可能是通过调控NOX2/ROS/NLRP3活化，减少IL- 1β的释放，保护肝细胞，减少肝内胶原沉积实现的。

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怀孕可能会刺激妇女的脑部变化

据美国WebMD医学新闻网(2016- 12- 20)报道，新手妈妈经常说她们自己是“婴儿大脑”，这似乎是伴随着怀孕与分娩的一种新想法，而新研究认为这是正确的。

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无论妇女是自然怀孕还是通过生育治疗受孕，这些变化是相似的。

该研究发表于2016- 12- 19NatureNeuroscience。