柠檬苦素抑制PM2.5吸入诱导的大鼠气道炎性反应及黏液高分泌状态

刘美花，周向东

(海南医学院第一附属医院 呼吸内科，海南 海口 570102)

黏液高分泌是慢性气道炎性反应疾病最突出的病理表象，过量分泌的黏液既阻碍正常黏液纤毛清除机制，又易潴留于气道，引起细菌定植，导致反复感染和顽固性炎性反应[1]。目前针对黏液高分泌的治疗已获得一定的临床效果，但许多治疗药物存在作用靶点分布广、缺乏组织特异性等问题，因而找到一种肺组织特异性的干预靶分子对其治疗具特殊意义。近些年研究发现肺组织表达一种与感知苦味质密切相关的苦味受体(bitter taste receptors, TAS2Rs)[2- 3]，目前对TAS2Rs的研究主要聚焦其支气管舒张作用，而对其在气道黏液分泌中的作用涉及甚少，基于对气道具有舒张作用的物质对气道黏液的分泌也具有不同程度的作用，采用中药陈皮中的苦味组分柠檬苦素为干预因素，观察气道TAS2Rs的激活表达对气道黏蛋白分泌的影响及机制，藉此为气道黏液高分泌的靶向治疗提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

SPF级Wistar大鼠，雌雄不限，4～6周龄，体质量(200±20)g[广东省医学实验动物中心，生产许可证号：SCXK(粤)2013- 0002]；中药单体化合物：柠檬苦素(陈皮提取物，质量分数99.5%，西安开来生物工程有限公司)；TH- 150C型大容量大气总颗粒物智能采样器(Andersen公司)；石英纤维膜(Whatman公司)；兔抗鼠β-Actin抗体(碧云天生物技术有限公司)；兔抗鼠TAS2R14多克隆抗体、HRP标记的山羊抗兔IgG、兔抗鼠IL- 1β抗体(Abcam公司)；兔抗鼠MUC5AC、MUC5B单克隆抗体(北京博奥森生物公司)；GAPDH(Sigma公司)；兔抗大鼠中性粒细胞趋化因子(CINC- 1)抗体(Assay Designs公司)；MUC5AC、MUC5B ELISA试剂盒(名劲生物科技有限公司)；RT-PCR试剂盒、RNA抽提试剂盒(TaKaRa公司)；RIPA裂解液(博士德生物)；所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 PM2.5 的采集及悬浮液的制作: 到建筑工地附近，用智能采样器采集空气中的PM2.5颗粒物，将颗粒物采集在30 cm×20 cm的石英纤维滤膜上，连续采样24 h，采集连续1个月，剪短吸附PM2.5的石英纤维滤纸，将滤纸对折后侵入超纯水，以超声波低温振荡30 min，再用纱布过滤洗脱液，将滤液置于4 ℃、10 000 r/min下离心3次，每次20 min，弃上清并称质量后，保存于-20 ℃冰箱，用0.9%氯化钠溶液配成40 μg/mL颗粒物悬液，超生振荡20 min后混合均匀，保存于4℃冰箱备用。

1.2.2 实验动物分组: 将大鼠随机分为空白对照组、PM2.5组[以PM2.5的颗粒物悬液(40 μg/mL)6 mL经超声雾化吸入进行毒染，约30 min/次，1次/d，染毒温度37 ℃，染毒时间持续4周，制成慢性气道炎性反应的动物模型]和PM2.5+柠檬苦素组(在给予PM2.5毒染1 h后给予雾化吸入20 μmol/L的柠檬苦素溶液6 mL，约30 min/次，1次/d)，每组10只。于第28天处死，均在末次染毒实验处理结束24 h后处死，分别经气管插管收集肺泡灌洗液，剥离气管和肺脏，将其收集于-80 ℃冻存备用。

1.2.3 ELISA检测BALF中MUC5AC、MUC5B的含量: 所有大鼠腹腔麻醉后，收集BALF，回收量不少于5 mL，经 1000 r/min离心10 min，取BALF上清液备用。按试剂盒说明书进行标准品的稀释和加样。加样：分别设3个复孔，分别取BALF上清液100 μL包被酶标板，于4℃冰箱过夜，采用含1%牛血清白蛋白的PBS-Tween 20于37 ℃下封闭60 min，MUC5AC、MUC5B一抗以l∶500倍稀释，分别取100μL，37 ℃孵育60 min，HRP标记羊抗鼠IgG以1∶1 000稀释，取100 μL，37 ℃孵育60 min，底物溶液100 μL，于37 ℃显色15 min后停止反应。最后于492 nm处测吸光度作为MUC5AC、MUC5B含量的相对值(A值)。

1.2.4 RT-PCR检测支气管肺组织中TAS2R14、IL- 1β、CINC- 1、MUC5AC和MUC5B的mRNA含量： 采用Trizol法提取各组肺组织的总RNA，用分光光度计测定总RNA浓度及在260 nm和280 nm的吸光度(A)值，样品A260/A280比值均介于1.6～1.8，样品总RNA初步定量，-20 ℃保存备用。两步法进行RT-PCR。参照cDNA合成试剂盒说明书合成cDNA第一链。引物序列见表1。灭菌PCR管中依次加入MgCl：(25 mmoL/L)4.0 μL、10×PCR反应缓冲液5.0 μL、上下游引物各1.0 μL、dNTP 4.0 μL、cDNA 2.0 μL、Taq酶(5×106U/L) 0.5 μL，用ddH2O定容至50.0 μL，轻轻混匀离心后于PCR仪行PCR扩增。于94 ℃预变性3 min，后紧随35个循环，循环参数：94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，后72 ℃延伸5 min补齐末端。产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳结果经吸光度面积积分分析，以与管家基因GAPDH mRNA的比值，作为目的基因mRNA的相对值。

1.2.5 Western blot检测TAS2R14、IL- 1β、CINC- 1、MUC5AC和MUC5B蛋白含量： 称取0.1 g各实验大鼠的肺和气管组织，加入1 mL RIPA裂解液匀浆10 min，置于冰上裂解10 min后，4 ℃12 000 r/min离心10 min，取上清液，用蛋白定量试剂盒对上清液进行蛋白定量，分装后，置于-20 ℃冰箱保存备用。各组蛋白样品经SDS-PAGE凝胶电泳分离，将蛋白印迹转移至PVDF膜，将PVDF膜于5%脱脂牛乳(PBS稀释)中封闭l h，加入兔抗鼠TAS2R14多克隆抗体(稀释倍数为1∶500)，IL- 1β、CINC- 1、MUC5AC、MUC5B和β-actin抗体(稀释倍数均为1∶1 000)，置于4 ℃冰箱孵育过夜，次日取出于室温下孵育1 h，不断摇晃，洗涤3次后加入HRP标记的山羊抗兔IgG(1∶2 000)，室温下孵育1 h。充分洗涤后经ECL显色，加入底物与反应液，于暗室内曝光5 min。结果经吸光度值分析，以与内参照β-actin产物条带的比值作为相对含量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 ELISA检测BALF中MUC5AC、MUC5B蛋白分泌情况

PM2.5刺激组MUC5AC、MUC5B蛋白分泌水平显著高于对照组(P<0.01)；柠檬苦素干预组的MUC5AC、MUC5B蛋白分泌水平进一步升高(P<0.05)(表2)。

表1 RT-PCR各目的基因引物序列Table 1 The primer sequenc of target genes for RT-PCR

表2 各组的黏蛋白分泌表达

*P<0.01 compared with the control group;#P<0.05 compared with PM2.5 group.

2.2 RT-PCR检测支气管/肺组织TAS2R14、IL- 1β、CINC- 1、MUC5AC、MUC5B mRNA的转录情况

PM2.5刺激组中，IL- 1β、CINC- 1、MUC5AC和MUC5B mRNA表达水平均高于对照组(P<0.05)；柠檬苦素干预组的TAS2R14 mRNA表达水平比PM2.5刺激组明显增加(P<0.05)，而IL- 1β、CINC- 1、MUC5AC和MUC5B的mRNA表达水平则降低(P<0.05)(图1，表3)。

1.control group； 2.PM2.5 group；3.PM2.5+ limonin group图1 各组黏蛋白、炎性反应因子和苦味受体的 mRNA表达水平Fig 1 The mRNA expression levels of mucins, inflammatory cytokines and bitter taste receptor in each group

2.3 Western blot法检测大鼠支气管/肺组织中TAS2R14、IL- 1β、CINC- 1、MUC5AC、MUC5B蛋白表达情况

与对照组相比较，PM2.5组中的IL- 1β、CINC- 1、MUC5AC、MUC5B蛋白含量明显升高(P<0.05)；与PM2.5组相比，柠檬苦素干预组的IL- 1β、CINC- 1蛋白表达水平减少(P<0.05)，MUC5AC、MUC5B蛋白表达也降低(P<0.05)，但TAS2R14蛋白表达水

平则明显升高(图2，表4)。

3 讨论

气道黏液高分泌是慢性气道炎性反应疾病的病理特征之一，目前已被视为慢性阻塞性肺疾病和哮喘发病率及病死率升高的独立危险因素[4]。黏蛋白是构成气道黏液的主要成分，目前已发现21种MUC基因， 其中MUC5AC和MUC5B是气道中主要的分泌型，MUC5AC/MUC5B的比值对维持黏液性状有突出作用。临床上针对黏液高分泌的恶心类祛痰药物的作用机制便是通过促进浆液性的MUC5B分泌而使黏液稀释易于纤毛排出[5]。

1.control group；2.PM2.5 group；3.PM2.5+ limonin group图2 各组黏蛋白、炎性反应因子和苦味受体的蛋白水平Fig 2 Protein levels of mucins, inflammatory cytokines and bitter taste receptor in each group

groupMUC5ACMUC5BIL⁃1βCINC⁃1TAS2R14control023±004022±007028±005027±011025±009PM25056±009∗050±011∗069±004∗058±006∗027±007PM25+limonin041±012#043±002#045±010#041±003#053±007#

*P<0.05 compared with the control group;#P<0.05 compared with PM2.5 group.

表4 各组的黏蛋白、炎性反应因子及苦味受体蛋白表达Table 4 Protein expression results of mucins, inflammatory cytokines and bitter taste receptor in each

*P<0.05 compared with the control group;#P<0.05 compared with PM2.5 group.

TAS2Rs是哺乳动物体内感知苦味的一种味觉感受器[6]，对气道TAS2Rs研究表明苦味刺激会激活TAS2Rs，产生平滑肌舒张和支气管扩张效应[7- 8]，表达于气道上皮细胞运动纤毛的TAS2Rs可加快纤毛摆动频率[9]，甚至有称TAS2Rs活化可诱导细胞抗菌肽分泌而具有抗菌作用[10- 11]。鉴于临床上的恶心类祛痰剂诸如陈皮、桔梗、前胡等中药的药用组分多数带有苦味，故而认为气道TAS2Rs的激活对黏液的分泌也具有一定作用。

本实验选取肺组织高表达的TAS2R14为靶分子研究其对气道黏液高分泌的影响。实验结果显示：PM2.5组的气道炎性反应因子IL- 1β和CINC- 1、黏蛋白MUC5AC和MUC5B的转录和蛋白表达水平均升高，形成气道炎性反应和黏液高分泌状态，从ELISA检测结果看，分泌的黏蛋白以黏液性的MUC5AC为主。而柠檬苦素干预组的MUC5AC和MUC5B的产生表达较PM2.5组均有所减少，表明柠檬苦素具抑制气道黏液合成作用。柠檬苦素刺激后TAS2R14的表达明显增加，与黏蛋白及炎性反应因子的表达呈反比关系，提示TAS2R14对气道黏蛋白的产生具抑制效应，此效应与炎性因子IL- 1β、CINC- 1产生减少有关。IL- 1β是慢性炎性气道上侵润的主要炎性细胞因子之一，IL- 1β可通过激活PKC信号通路及p38MAPK信号传导通路介导MUC5AC基因的表达并促进MUC的分泌[12]。CINC- 1则是炎性反应过程中产生的趋化因子，是大鼠体内起白介素- 8作用的类似物，主要介导中性粒细胞的趋化[13]，而后者释放的弹性蛋白酶是目前巳知的最强促黏液分泌因子，具使MUC合成增加及导致气道上皮杯状细胞化生等多种气道损害作用[13]。肺组织TAS2R14的激活可抑制IL- 1β和CINC- 1介导的炎性反应细胞趋化作用，进而阻止由炎性反应因子释放诱导的黏液高分泌。此外，TAS2R14激活后，灌洗液中MUC5AC和MUC5B的分泌量均增多，且以浆液性MUC5B增加为主，这与恶心类祛痰剂陈皮、桔梗等中药通过促进浆液性的MUC5B分泌而使黏液稀释的机制相符合。

目前已知呼吸道TAS2Rs的激活可舒张支气管、降低气道阻力和增加黏液纤毛清除效率。本实验则表明，在气道炎性黏液高分泌形成过程中，TAS2Rs的激活还具有抑制炎性因子及黏蛋白产生和促进黏蛋白分泌的作用，提示TAS2Rs对慢性气道炎性疾病的治疗具多种有益效应。这为临床研究炎性气道的黏液高分泌治疗药物提供新的干预靶点和理论依据。

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