乳腺癌组织中JARID1B/KDM5B的表达与血液循环肿瘤细胞相关性

赵丽华，位 嘉，槐英丽，张晓敬，张 超，林秋兰，王克杰，闫红燕，郭家良，李秋颖

(民航总医院 病理科，北京 100123)

乳腺癌作为女性最常见的恶性肿瘤，寻找一种无创、敏感的方法监测肿瘤进展情况，及时调整治疗方案是目前治疗中亟待解决的问题。

1896 年在一例因肿瘤死亡的患者外周血中发现了类似肿瘤细胞的细胞， 并提出循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)这一概念。 CTC 的定义为自发或因诊治过程中导致原发病灶或转移病灶播散进入外周血循环的肿瘤细胞[1]。在外周血中约每106～107个白细胞中可能仅有1个CTC[2]。CTC检测被看作液体活检，对于肿瘤患者的预后判断、疗效评价以及个体化治疗均有重要的指导作用[3]。

本研究应用将FISH与免疫荧光抗体技术相结合，探讨检测乳腺癌肿瘤组织中JARID1B/KDM5B的表达是否可以作为患者肿瘤转移、复发监测的指标之一。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 对象：收集2014—2016年民航总医院术前37例影像学诊断可疑乳腺癌患者，患者年龄介于32～61岁，平均年龄43岁，经知情同意告入选此课题，患者术前未做任何治疗，于术前抽取5 mL外周静脉血，应用imFISH方法进行外周血液循环肿瘤细胞检测，术中行冰冻病理检查，其中35例患者确诊为浸润性乳腺癌，术后肿瘤标本进行免疫组化检测肿瘤组织中组蛋白去甲基化酶JARID1B/KDM5B的表达，该项目已通过民航总医院伦理委员会批准。

1.1.2 试剂：鼠抗P16单抗和S-P免疫组化试剂盒(福州迈新生物技术有限公司)；鼠抗JARID1B/KDM5B单抗(DAKO生物试剂公司)。

1.2 方法

1.2.1 病理诊断依据：所有病理切片由两位副高级以上病理学专家依据2016版WHO标准诊断。

1.2.2 病理诊断标准：两名医师依据世界卫生组织(WHO，2016版)的分类系统进行肿瘤组织分型及分级，所有患者根治性术后石蜡病理诊断为乳腺浸润性导管癌Ⅱ-Ⅲ级。

1.2.3 免疫组化S-P法检测和结果判定：JARID1B/KDM5B阳性物质定位于细胞核，JARID1B/KDM5B阳性细胞绝对值计数时注意选取阳性细胞高度密集的区域，并且取显微镜下4个高倍镜视野的平均值。依据阳性细胞数：0级：≤10%；1级：10%～25%；2级：25%～50%；3级：50%～75%；4级：>75%。依据染色强度：1)弱阳性；2)中等强度阳性；3)强阳性。IHC最终得分：0：阴性(-)；1～4：弱阳性(+)；5～8：中等强度阳性(++)；9～12：强阳性(+++)。病理切片由两名以上副主任医师阅片，进行病例的筛选、分组及免疫组化等阳性结果的判定。

1.2.4 imFISH(免疫荧光原位杂交)法检测:阴性富集：每例患者的采血抽取外周血至ACD抗凝管中，立即颠倒混匀8次,采用莱尔生物医药科技有限公司的阴性富集法对外周血3.2mL进行获取CTC处理，具体操作如下：1)离心去除血浆蛋白：用CS1溶液将离心管内液体体积分别补充至45 mL(650×g离心5 min)，去上清至12 mL；2)去除红细胞：两管分别加CS2溶液至45 mL。将离心管置于垂直混匀仪混匀，室温8 min(650×g离心5 min)，弃上清至1～2 mL；3)去除白细胞：按每管100 μL的比例，将偶联了抗人白细胞表面抗原单克隆抗体组合群的免疫磁微粒缓慢加入上述样本中，固定于摇床上，室温摇动20 min；4)涂片：最后经离心、富集，去除上清液后，剩余100 μL细胞悬液，将细胞涂于特殊载玻片上，使用固定液CF1对标本固定，过夜干燥。

imFISH鉴别CTC:荧光原位杂交选用CEP8/CEP17两种标志物(雅培)。标本脱水后，加入预混的CEP8/CEP17探针10 μL，盖上盖玻片，放入杂交仪(DAKO)，进行75 ℃变性5 min、杂交1.5 h。CD45免疫荧光染色1 h，滴加DAPI，封片。

在自动扫描及分析系统(Cyttel PathfinderTM系统)下对标本区进行自动扫描及分析，CEP8/CEP17均以信号点≥3个为阳性，而满足CEP8+/CD45-/DAPI+或CEP17+/CD45-/DAPI+的细胞视为阳性细胞。

1.3 统计学分析

采用SPSS19.0(SPSS Inc. Chicago, IL, USA)软件统计分析数据，采用χ2检验Spearman’s等级相关性分析。

2 结果

35例确诊为乳腺浸润性导管癌患者中CTC检测阳性病例(CTC数目≥2)27例，阴性病例(CTC数目<2)8例，上述病例相对应癌组织中的JARID1B/KDM5B免疫组化结果见表1，JARID1B/KDM5B的阳性表达强度与患者血液学患肿瘤细胞数(CTC)呈正相关(P<0.01)(图1A～C)。

表1 KDM5B的表达与循环肿瘤细胞相关性的分析

rs=0.509,*P<0.01.

3 讨论

通常把进入人体外周血的肿瘤细胞称为CTC，迄今已有证据表明恶性肿瘤在早期就有癌细胞脱落进入到循环系统，这些脱落的癌细胞自原发灶脱落后进入到血循环，再穿透血管壁到继发部位种植，但它们必须逃避机体的免疫监测，并在多种因子作用下刺激肿瘤血管生成才可能形成转移灶。血循环中检测到CTC 并不意味着有远处转移，但转移的概率会大大增加[4]。CTC检测技术应用于多种肿瘤的检测中，对138例转移性乳腺癌患者在治疗前和治疗后10周进行影像学评估，发现20例(14%)影像学进展且CTC<5的患者中位OS明显长于22例(16%)影像学进展且CTC≥5的患者；影像学评价在2位影像科医师之间的变异率为15.2%，而CTC在不同实验室评价的变异率仅为0.7%。结果显示CTC评估比现有影像学方法更早、重复性更好用于指示疾病情况[5]。在前瞻性、双盲和多中心大型临床研究中[6]，第一次证实了CTC检测在中国转移性乳腺癌中的应用价值，研究证实CTC水平与转移部位、激素受体状态及HER- 2状态相关，首次随访的CTC数目也可预测PFS及OS。CTC检测作为标准的影像学检查手段之外的辅助评估方法， 其优势在于能更早判断疾病进展，为患者及时调整治疗方案提供更多帮助。

A.invasive breast carcinoma HE high magnification； B.the strong expression of JARID1B/KDM5B in cancer tissues S-P method high magnification； C.CTC 7 imFISH high magnification

图1乳腺癌组织学及循环肿瘤细胞
Fig1BreastcarcinomatissueandCTC(×200)

组蛋白去甲基化酶JARID1B/KDM5B最初是在乳腺癌中过度表达而分离得到的， JARID1B/KDM5B在乳腺癌中的表达与ER阳性具有很强的相关性，广泛地表达在ER阳性的乳腺癌和乳腺癌细胞系，有研究证实JARID1B/KDM5B蛋白的阳性表达率与乳腺癌肿瘤的大小、淋巴结转移、R&B评分呈正相关性[7]。

本研究应用imFISH方法初步证实联合CTC的检测及乳腺癌组织中JARID1B/KDM5B的表达，对判断肿瘤复发、肿瘤转移具有一定的预测价值，鉴于JARID1B/KDM5B在乳腺癌组织与正常组织中表达的差异性，JARID1B/KDM5B也可能会成为乳腺癌治疗的一个新靶标。

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