青少年起病的成人型糖尿病相关基因新突变位点的发现

李怡心，李玉秀，常永生*

(1.中国医学科学院 基础医学研究所 北京协和医学院 基础学院 医学分子生物学国家重点实验室， 北京 100005； 2.中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 内分泌科 卫生部内分泌重点实验室， 北京 100730)

于20世纪60年代首次发现，青少年起病的成人型糖尿病(maturity-onset diabetes of the young，MODY)最初用于描述儿童或青年的持续性、无症状的高血糖[1- 2]。现在，MODY主要指由常染色体显性基因突变所引起的遗传性糖尿病[3]。MODY是单基因糖尿病中最常见的类型， 在欧洲，MODY约占所有

糖尿病病例的1%～2%[1，4]。目前，已经发现13个基因(HNF4α、GCK、HNF1α、PDX1、HNF1β、NEUROD1、KLF11、CEL、PAX4、INS、BLK、ABCC8和KCNJ11)的突变与MODY发病有关[5- 7]。

由于临床表现和发病年龄的相似，MODY经常被误诊为1型或2型糖尿病。鉴于不同类型糖尿病的治疗方式和预后均有所差异，且MODY具有明确的家族遗传性，因此正确的诊断对于MODY患者及其亲属具有重要意义。本研究旨在通过全外显子组测序筛查新的MODY相关基因或突变位点，为MODY的临床诊断补充依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象：选取2016年4月至2016年8月在北京协和医院内分泌科就诊的临床疑诊为MODY的患者8例，结合本研究的目的，对满足以下条件的4例患者进行全外显子组测序：1)糖尿病诊断年龄<25岁；2)家族成员中至少连续2代有糖尿病；3)自身抗体(IAA、ICA和GAD)阴性。所有进行全外显子组测序的患者均在签署知情同意书后登记病历资料并留取血液标本，对于年龄小于18周岁的研究对象，同时获得其监护人的知情同意并签署知情同意书。本研究获得北京协和医院伦理委员会的批准。

1.1.2 材料：血液基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)。GCK及HNF4α扩增序列引物(Invitrogen公司)。LA Taq DNA聚合酶、dNTPs(TaKaRa公司)。琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(美基生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取：提取患者抗凝全血标本的基因组DNA，NanoDrop2000超微量分光光度计测得浓度>50 mg/L，DNA总量>3 μg。

1.2.2 全外显子组测序：所得DNA样本送至诺禾致源公司进行全外显子组测序，捕获平台Agilent SureSelcet Human All Exon V6，测序平台HiSeq 4000 PE150，有效测序深度达到100×以上。

1.2.3 PCR法扩增突变位点所在外显子：以基因组DNA为模板，在T100TMPCR仪上进行扩增反应。条件为：95 ℃ 5 min、(95 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min)29个循环、72 ℃ 10 min。所得PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行分离并纯化，纯化产物浓度>50 mg/L。

1.2.4 Sanger测序验证突变位点：对PCR回收纯化产物进行测序，与已知序列对比，验证全外显子组测序结果(表1)。

表1 PCR的引物序列Table 1 The sequences of PCR primers

2 结果

2.1 测序患者的临床指标

测序的4例患者来自4个不同的家族，2例男性2例女性，每例患者家族中患有糖尿病的人数为3～5人(图1)。4例患者诊断为糖尿病时的平均年龄为(17.85±3.3)岁，进行本次测序时的平均年龄为(22.4±6.4)岁，平均BMI为(23.00±2.84) kg/m2，具体临床指标(表2)。

2.2 新的突变位点

在患者01和患者02中均未检测到MODY相关基因的已报道或未报道突变。

在患者03中检测到了位于GCK基因10号外显子上的新的突变位点c.1348G>T (p.Ala450Thr)(图1)。该患者的父亲也患有糖尿病，后续对其父亲的基因组DNA进行测序验证，结果显示具有相同的突变位点(图2)。

在患者04中检测到了位于HNF4α基因7号外显子上的新的突变位点c.758G>A (p.Arg253Gln)(图1)。该患者的母亲也患有糖尿病，后续对其母亲的基因组DNA进行测序验证，结果显示具有相同的突变位点(图3)。

3 讨论

GCK和HNF4α突变所导致的MODY分别为MODY2和MODY1，是除了HNF1α突变所致的MODY(MODY3)外最常见的MODY亚型[8]。

A.pedigree of family 01; B.pedigree of family 02; C.pedigree of family 03; D.pedigree of family 04; show the patients with diabetes, show family members without diabetes; represent for male individuals, represent for female individuals; P01-P04 are the subjects we selected; number 1-7 represent for members from each family

图1 4例测序患者的家族系谱图Fig 1 Family trees of the four patients being sequenced

BMI.body mass index; FFA.free fatty acid; UA.uric acid; UAE.urinary albumin excretion; ND.non did.

The G>T mutation in exon 10 of GCK gene from family 03; the patients with GCK gene mutations show a high level of fasting blood glucose; A.the normal base G of this site; B.the novel c.1348G>T mutation in patient 03,the proband in family 03; C.the novel c.1348G>T mutation in patient 03’s father; patient 03 and patient 03’s father have the same mutation,but different peak height G/T ratio图2 患者03及其父亲中检测到的新突变位点Fig 2 Novel mutation detected in patient 03 and her father

The G>A mutation in exon 7 of HNF4α gene from family 04; patients with HNF4α gene mutations have a low renal threshold and are sensitive to sulfonylureas; A.the normal base G of this site; B.the novel c.758G>A mutation in patient 04, the proband in family 04; C.the novel c.758G>A mutation in patient 04’s mother; patient 04 and patient 04’s mother have the same mutation, but different peak height G/A ratio; the peak height of base G is different between normal sample and mutation samples图3 患者04及其母亲中检测到的新突变位点Fig 3 Novel mutation detected in patient 04 and his mother

GCK(glucokinase葡萄糖激酶)是葡萄糖磷酸化过程中的限速酶，且具有调节胰岛素分泌的功能，由位于染色体7p13的GCK编码，该基因的杂合突变可导致MODY2的发生。GCK主要在胰岛β细胞中表达，也可见于肝细胞、神经和神经内分泌细胞[8]。MODY2的临床表现主要为无症状、非进行性、轻度的高血糖。MODY2患者通常不需要进行药物治疗，仅通过控制饮食和适量运动就可以控制血糖水平，且预后良好[9]。

HNF4α是一种细胞特异性转录因子，主要在肝脏中表达，也存在于胰腺和肾脏中。HNF4α发生突变会导致胰岛β细胞功能障碍，从而导致高血糖的发生。MODY1较为少见，其临床表现与MODY3相似，且对小剂量的磺脲类药物治疗敏感。有研究显示，在无HNF1α突变的疑诊MODY3患者中，有10%～29%具有HNF4α突变[10]。

准确的诊断MODY对于临床医生选择治疗方案及为患者亲属提供遗传学咨询具有重要意义。由于MODY的临床表现与1型和2型糖尿病存在相似之处，且我国对MODY的研究起步相对较晚，尚未形成系统的诊断流程，因此大部分MODY患者被误诊为1型或2型糖尿病甚至未被明确诊断。基因测序有助于MODY的确诊并明确具体的MODY亚型，从而使患者及其亲属能够得到正确、及时的诊断和治疗。

本研究发现的GCK和HNF4α的新的突变位点帮助诊断了两位患者确为MODY患者，并据此对患者的相关亲属进行了测序，有助于其后续治疗方案的调整，也为进一步研究MODY相关基因的功能及临床上对于MODY的诊断提供了依据。

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据英国《BBC新闻》(BBCNEWS)2016年12月13日报道，根据一份现有研究，勃起功能障碍在罹患牙周病的男性中很常见。研究人员分析了2009至2014年发表的5项研究数据，包括一项随机对照试验，总计涵盖213 000名20至80岁男性的资料。

在每项研究中发现，勃起功能障碍更普遍地出现在正在治疗牙周病的患者中，特别是年龄小于40岁和大于59岁的男性。根据研究报告，罹患牙周病的男性有勃起功能障碍是没有牙周病男性的2.28倍。

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本研究刊登于InternationalJournalofImpotenceResearch。