HIPK3基因3′UTR 双荧光素酶报告质粒的构建及其与靶向miR- 146的验证

杨开雯，强 郑，靳文雨，刘 昉

(桂林医学院 基础医学院 人体解剖学教研室， 广西 桂林 541004)

微小RNA(miRNAs)是一种长度为18～25个核苷酸的小分子，通过作用于靶基因3′端非编码区(untranslated regions，UTR)的特定序列，切割降解靶基因的mRNA分子，调节靶基因的翻译，从而发挥调节效应[1]。有数据显示，miRNAs参与30%～50%基因的表达调控[2]。因而 miRNA 靶标的检测逐渐成为研究 miRNA 功能的重要环节。同源性的蛋白质激酶3(homeodomain-interacting protein kinases，HIPK3)是一种已知的胰岛素分泌调节剂，与人类2型糖尿病有关联[3]。同时，发现在HIPK3敲除小鼠中出现胰岛素分泌受损[4]。先前在糖尿病心肌病实验模型中检测到小鼠心脏的miR- 146水平显著降低，HIPK3的mRNA水平显著升高。比对miRDB 数据库和DIANA TOOLS数据库预测结果显示，miR- 146与HIPK3基因 3′UTR可能存在互补结合位点。因此，推测，HIPK3有可能是miR- 146的靶基因。本研究通过构建HIPK3基因3′UTR野生型和突变型双荧光素酶报告载体，分析miR- 146a mimics和miR- 146b mimics对含有野生型和突变型HIPK3基因3′UTR的双荧光素酶报告载体活性的影响，为后续深入探讨miR- 146及HIPK3在糖尿病心肌病发病机制中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试剂及材料

miR- 146a mimic、miR- 146b mimic、NC片段和PCR引物 (广州锐博公司)；人胚胎肾上皮细胞系- 293T细胞(上海锐赛公司)；psicheck2质粒、DMEM和转染试剂POLO3000(上海锐赛公司)；Trizol、T4 DNA连接酶及限制性内切酶(TaKaRa公司)；反转录试剂盒(Fermentas公司)；SYBR Green mix(诺维赞公司)；双荧光素酶检测试剂盒(Promega公司)。

1.2 方法

1.2.1 靶基因预测：miRDB 数据库和DIANA TOOLS数据库预测交叉结果显示，预测miR- 146与HIPK3可能的靶向结合位点，预测结果取交集。

1.2.2 荧光素酶报告载体的构建：根据HIPK3基因的3UTR区序列设计并合成PCR 引物，HIPK3-XhoⅠ-F：5′-TCAGctcgagATACACTGCAAGGTGTAG GAAGATT-3′，HIPK3-PmeⅠ-R：5′-AGTGCgtttaaacTT TGCCGCAATATATATATTTTAATTC-3′，下划线标记为XhoⅠ、PmeⅠ的酶切位点序列，预计扩增片段长度396 bp。基因全长的PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，并用AXGGEN胶回收试剂盒回收目的片段。将目的基因PCR产物和目的载体用XhoⅠ和PmeⅠ分别37 ℃酶切4～5 h后，电泳分离酶切片段，切胶回收目的片段。T4 DNA ligase 连接酶切后的PCR产物及目的载体，并将10 μL连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布于含抗性的LB平皿，37 ℃培养过夜。次日，挑取单菌落进行菌落PCR，将PCR鉴定呈阳性的克隆接种到LB液体培养基中，摇菌过夜，次日抽提质粒。应用引物(Fm:5′-AGTATTTCTCTCTGTGATTTAAATGTGAC-3′；Rm：5′-CACATTTAAATCACAGAGAGAAATACTATCG-3′)获得突变质粒。将菌落PCR呈阳性的克隆送上海锐赛公司测序，并进行序列比对，将测序正确的重组质粒分别命名为HIPK3-WT(野生型)，HIPK3-MU(突变型)。

1.2.3 细胞培养及miR- 146a mimic、miR- 146b mimic瞬时转染293T细胞：用DMEM高糖培养基进行293T细胞培养及传代。转染前24 h，利用胰蛋白酶消化细胞，接入6孔板中培养，待细胞增值至70%～80%汇合度时进行转染。配制转染试剂混合物：A管：取miR- 146a mimic(5 nmol/L)+ miR- 146b mimic(5 nmol/L)2 μL与100 μL基本培养基混匀；B管：6 μL转染试剂与100 μL基本培养基混匀。将B管溶液加入A组各管中，混匀，分别均匀滴加到培养板的细胞中， 37 ℃培养箱中孵育。转染24 h后，荧光显微镜观察细胞的转染效率。从转染的目的细胞中提取总RNA，根据反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，以反转录的cDNA为模板进行荧光定量PCR，用2-△△Ct法计算各基因的表达相对定量。

1.2.4 海肾荧光目的质粒、萤火虫荧光内参质粒共转293T目的细胞：转染前24 h，利用胰蛋白酶消化293T细胞，接入24孔板中培养。转染当天，从细胞中移除培养基，换上新鲜的不含抗生素完全培养基，37 ℃孵育。配制转染试剂混合物：A管：取HIPK3-WT质粒(250 ng)和HIPK3-MU质粒(250 ng)总量0.5 μg与 25 μL基本培养基混匀；B管：3 μL转染试剂与25 μL基本培养基混匀。将B管溶液加入A组各管中，混匀，取上述转染混合液分别均匀滴加到培养板的细胞中，37 ℃培养箱中孵育。转染48 h后，荧光显微镜观察细胞的转染效率，收取检测样。各实验组设3个复孔，每组实验重复3次。转染细胞分组如下： 1)HIPK3-WT + NC阴性对照；2)HIPK3-WT+miR- 146a mimics；3)HIPK3-WT+miR- 146b mimics；4)HIPK3-MU+NC阴性对照；5)HIPK3-MU+miR- 146a mimics；6)HIPK3-MU+miR- 146b mimics。各转染组反应48 h后，消化细胞，对各组的荧光素酶活性进行检测。

1.2.5 双荧光素酶活性的检测：按照双荧光素酶检测试剂盒提供的操作方法，依次加入萤火虫荧光素酶及海肾荧光素酶底物，进行荧火虫荧光素酶(firefly luc)及内对照海肾素荧光素酶(renilla luc)荧光强度检测，计算firefly luc/renilla luc的比值，并以HIPK3-WT或HIPK3-MU与NC共转染293T细胞作对照。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 miR- 146与HIPK3靶点预测

miR- 146家族有两个成员，分别是miR- 146a和miR- 146b，二者在3′端非种子区有两个不同碱基。通过miRDB和DIANA TOOLS两个数据库的查询比对，发现miR- 146a和miR- 146b都可能靶向HIPK3基因，它们的可能结合位点都一样(图1)。这提示HIPK3极有可能是miR- 146a和miR- 146b的靶基因。

2.2 野生型及突变型重组双荧光素酶报告载体的构建

目的片段的PCR扩增得到长度为396 bp的HIPK3基因的3′UTR序列(图2)，连入载体，获得重组质粒，PCR验证与预期大小相符(图3)。HIPK3-WT重组载体进行测序，与DIANA TOOLS中HIPK3基因与miR- 146结合位点序列一致(图4)。HIPK3-MU重组载体进行测序可见HIPK3与miR- 146结合位点缺失(图5)。

2.3 验证miR- 146a mimic和miR- 146b mimic细胞转染效率

转染了miR- 146a mimic和miR- 146b mimic的细胞中，miR- 146a和miR- 146b表达显著升高，说明转染成功(图6)。

2.5 野生型和突变型重组报告载体的活性分析

各组转染细胞相对荧光素酶活性(表1)，共转染miR- 146b mimic和HIPK3-WT(t=4.175，P<0.05)的荧光素酶活性下降，而共转染miR- 146a mimic和野生型HIPK3-WT的荧光素酶活性无明显变化；另外，共转染miR- 146a mimic和HIPK3-MU的荧光素酶活性与共转染miR- 146b mimic和HIPK3-MU的荧光素酶活性都没有出现明显变化。

A.prediction of the binding site of HIPK3 with miR- 146a; B.prediction of the binding site of HIPK3 with miR- 146b图1 miR- 146与HIPK3结合位点的预测Fig 1 Prediction of the binding site of HIPK3 with miR- 146

1.marker-DL2000; 2-4.HIPK3 3′UTR PCR amplifiction图2 HIPK3 3′-UTR PCR扩增电泳结果Fig 2 The results of the HIPK3 3′-UTR PCR amplifiction electrophoresis

1-10.wild type recombinant PCR amplification;11.marker-DL2000图3 重组野生型载体菌落PCR鉴定Fig 3 Wild type recombinant plasmid colony PCR identification

A.contrast of sequencing between the wild type vector and the target fragment; B.partial sequencing analysisdiagram of wild type vector

A.contrast of sequencing between the mutant vector and the target fragment; B.partial sequencing analysisdiagram of mutation vector

图6 qPCR 检测转染后细胞内miR- 146a和miR- 146b的表达Fig 6 qPCR detects the expression of miR- 146a and miR- 146b after transfection

groupsratiooffluorescenceintensityWT+NC 0881±0026MU+NC 0870±0075WT+miR⁃146a 0815±0073MU+miR⁃146a 0740±0051WT+miR⁃146b 0630±0054∗MU+miR⁃146b 0671±0059

*P<0.05 compared with WT+NC group.

3 讨论

miRNAs 是通过对靶基因表达的调节并引发下游一系列的节联反应导致疾病的发生发展。miR- 146家族有miR- 146a和miR- 146b两种，二者位于不同的染色体，序列仅在3’端“非种子区”有两个不同碱基。miR- 146在2型糖尿病患者血清中表达减少是慢性炎性反应的标志[5]；miR- 146a在糖尿病肾[6]和糖尿病患者的血浆和角膜上皮组织[7- 8]表达增加，在糖尿病大鼠的坐骨神经[9]中下调；miR- 146b在糖尿病视网膜炎性反应患者中表达降低[10]，而在人和小鼠的心肌炎[11]、自发性心肌肥大、心力衰竭小鼠[12]的心脏中表达明显上调。这些研究都显示出，miR- 146与糖尿病及心血管疾病的发生发展有很大联系。

HIPK3在糖尿病小鼠的胰岛中高表达[4]。在前期的实验中，HIPK3在糖尿病心肌病实验模型的表达明显升高，miR- 146表达下降，呈现出一种负相关关系。这说明，HIPK3在糖尿病以及其并发症的发病过程中具有重要作用。但是，HIPK3作用于miR- 146的具体靶点还需要实验进一步探索。生物信息学软件预测HIPK3有可能是miR- 146的下游靶基因，设计构建野生型和突变型HIPK3基因双荧光素酶报告载体实验。实验结果表明，共转染miR- 146a mimic和HIPK3-WT组的荧光素酶活性无显著变化，表明miR- 146a与HIPK3基因不具有靶向关系；共转染miR- 146b mimic和HIPK3-WT组的荧光素酶活性下降，说明miR- 146b能与HIPK3结合，从而抑制荧光素酶活性。也就是说miR- 146b可以特异性作用于HIPK3基因的 3′UTR位置的 313～320序列，说明miR- 146b对HIPK3基因有调控作用。这一结果为进一步研究 miR- 146b在糖尿病心肌病中的作用提供了部分参考。

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婴幼儿使用抗生素过敏症风险增加

据英国《BBC新闻》(BBCNEWS)2016- 09- 09报道，荷兰最新研究发现，两岁以下婴幼儿服用抗生素会增加罹患湿疹和花粉症等过敏问题的风险。

研究人员重新检视了1966至2015年的22项相关研究，分析了近40万患者的数据，以寻找抗生素使用与花粉热、湿疹等过敏症之间的联系。

在英国伦敦举行的欧洲呼吸学会(European Respiratory Society)年度会议上发表的研究结论是，婴幼儿时期使用抗生素的人患湿疹的风险较其他人增加15%～41%，患花粉症的风险则增加14%～56%。接受的抗生素疗程时间越长，罹上述疾病风险越高。

参与研究的荷兰Utrecht大学首席研究员法里巴·阿玛迪札(Fariba Ahmadizar)认为，其原因可能在于抗生素会扰乱人体免疫系统、破坏正常肠道菌群，导致日后接触无害外来物质时易发生过敏；此外，抗生素也会直接削弱人体免疫反应。

曾有研究者想找出低龄人群使用抗生素与过敏症之间的关联，但未能得出一致结论。学术界一直对发达国家人口的过敏率飙升不解，很多人提出可能是童年接触不同细菌所致，但确切的发病机制尚不清楚。

未参与研究的英国布里斯托尔大学(University of Bristol)儿科教授亚当·芬恩(Adam Finn)认为，这一发现进一步证实了使用抗生素会有长期的不良反应，医学界之前就对滥用抗生素导致的抗生素抗药性表示忧虑。

而另一方面，鉴于抗生素能有效对抗细菌感染，挽救了无数人的生命，芬恩和其他专家也表示，医生在使用抗生素时还须权衡利弊。