TRIM11靶向调控miR- 24- 3p促进乳腺癌细胞系MCF7增殖和侵袭

张 洋，张 静，季 琳，李文媛，王 莹，孙 平，于伟光

(牡丹江医学院1.解剖教研室；2.生物化学与分子生物学教研室；3.红旗医院 普外一科，黑龙江 牡丹江 157011)

乳腺癌是一种常见的恶性肿瘤，是全球女性因癌导致死亡的首要原因[1]，目前乳腺癌发病分子机制仍不明确。TRIM11 (tripartite motif-containing protein 11)是一种泛素E3连接酶，研究表明TRIM11为多种恶性肿瘤的致癌基因，在肝癌[2]、结肠癌[3]、人脑恶性胶质瘤[4]和肺癌[5]中表达上调，促进肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移。前期研究发现与3′-UTR TRIM11序列相匹配microRNAs(miRNAs)为miR- 24- 3p，认为TRIM11可能靶向调控miR- 24- 3p表达[3]。miR- 24- 3p已被证实可作为多种肿瘤的抑癌基因[6- 8]，因此推测TRIM11可能反向调控miR- 24- 3p表达促进乳腺癌细胞增殖和侵袭。

因此本研究拟探讨TRIM11 在乳腺癌组织和细胞中的表达，明确TRIM11高表达与患者预后的关系，证实TRIM11在体外对乳腺癌细胞增殖和侵袭的影响以及对miR- 24- 3p的靶向调控作用，为临床乳腺癌治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 临床资料和试剂

1.1.1 临床资料：选取牡丹江医学院附属红旗医院普外科2011年10月至2015年12月首次经手术治疗的原发乳腺癌患者31 例。均为女性，平均62.7岁。随访时间为10～60个月，平均32个月。乳腺癌癌旁正常组织31例为对照组。该研究经患者知情，并由牡丹江医学院附属红旗医院伦理委员会批准。

1.1.2 实验细胞和试剂：人乳腺癌细胞系(MCF7)和正常乳腺上皮细胞系(HMEC hTERT)(Sigma公司)；siRNA TRIM11慢病毒(piLenti-siRNA-TRIM11)、siRNA对照慢病毒(piLenti-siRNA-GFP)、miR- 24- 3p慢病毒(Lenti hsa-miR- 24- 3p)、miR对照慢病毒(pLenti-III-mir-Blank)(Ambion公司)；TRIM11、miR- 24- 3p、内参U6、GAPDH引物(Ambion公司合成)；双荧光素酶报告试剂盒(Promega公司)；四氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、TRIM11一抗(Sigma公司)；microRNA PCR Kit试剂盒(Exiqon公司)；Trizol提取液(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学染色检测乳腺癌组织TRIM11：按照试剂盒说明书步骤进行操作，其中一抗TRIM11(1∶200)。以PBS代替一抗作阴性对照。

1.2.2 细胞培养与慢病毒转染：用含10%胎牛血清的PRMI 1640培养基培养，置于37 ℃、5% CO2培养箱内培养MCF7和HMEC hTERT，3～4 d消化传代，取增殖状态良好的细胞用于慢病毒转染，在转染24 h前将细胞铺到6孔板中。每孔加入2 μL siRNA TRIM11慢病毒、siRNA对照慢病毒、miR- 24- 3p慢病毒和miR对照慢病毒，培养箱中孵育3 d。

1.2.3 实时定量PCR(RT-qPCR)：应用Trizol提取总RNA，通过反转录合成cDNA，根据说明书通过SYBR Green系统进行实时荧光定量。TRIM11引物如下：5′-GAGAACGTGAACAGGAAGGAG-3′；5′-CC ATCGGTGGCACTGTAGAA-3′。GAPDH引物如下：5′-ACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3′；5′-GACAAGCT TCCCGTTCTCAG-3′。miR- 24- 3p应用Mirvana RT-qPCR miRNA检测试剂盒进行检测。miR- 24- 3p引物如下：5′-UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG-3′；5′-ACCGAGUCAAGUCGUCCUUGUC-3′；U6引物如下：5′-CGAGCACAGAATCGCTTCA-3′；5′-CTCGCTTCG GCAGCACATAT-3′。

1.2.4 细胞增殖实验：细胞接种于96孔板，每孔2×103个细胞，培养6 d。在细胞增殖检测时间点，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT培养2 h，丢弃培养液，PBS冲洗，检测细胞增殖数量。每孔加入100 mL DMSO，波长570 nm测定吸光度值，检测细胞增殖活力[9]。

1.2.5 细胞侵袭试验：用Transwell检测细胞侵袭，(8～10)×104细胞加入到基质胶的上室，600 μL RPMI- 1640培养液注入下室。收集细胞后PBS冲洗和固定，0.1%结晶紫染色，拍照及显微镜下计数细胞个数[10]。

1.2.6 荧光素酶报告基因分析：从人基因组DNA中克隆TRIM11 3′-UTR，插入XhoⅠ与NotⅠ酶切位点之间，进行psiCHECK- 2荧光素酶基因报告，通过测序验证野生型和突变型的插入序列[3]。将细胞接种在24孔板中行miR- 24- 3p慢病毒或miR对照组慢病毒转染。根据说明书用双荧光素酶报告系统检测荧光素酶活性。

1.2.7 Western bolt检测TRIM11蛋白表达:用10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳提取蛋白质提取物，转移到PVDF膜，封闭后加入一抗TRIM11抗体(1∶1 000)或GADPH(1∶5 000)，二抗(1∶2 000)孵育2 h，TBS洗净，应用显色液显示后行吸光度分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 TRIM11在乳腺癌组织和细胞中表达及TRIM11与乳腺癌预后相关性

TRIM11在乳腺癌组织中高表达百分比为83.15%，明显高于正常组织的12.32%(图1A，B)。TRIM11高表达乳腺癌患者的生存率显著降低(P<0.05)(图1C)。此外， TRIM11在人乳腺癌MCF7细胞中的蛋白相对表达显著高于正常乳腺上皮HMEC-hTERT细胞 (P<0.001)(图1D, E)。

A.immunohistochemical analysis of TRIM11 expression in breast cancer tissue; B.percent of TRIM11 high expression in normal or tumor tissue was show,**P<0.001 compared with normal tissue; C.Kaplan Meier’s analysis of the correlation between TRIM11 high and low expression of breast cancer patients; D, E.Western blot analysis of TRIM11 expression in MCF7 cell and HMEC-hTERT cell，*P<0.01 compared with HMEC-hTERT

图1TRIM11在乳腺癌组织和MCF7细胞中表达上调及TRIM11高表达乳腺癌患者生存率降低

2.2 siRNA-TRIM11抑制乳腺癌细胞增殖和侵袭

siRNA-TRIM11慢病毒转染人乳腺癌MCF7细胞后TRIM11蛋白表达较对照组显著下调(P<0.001)(图2A，B)。体外培养4～6 d显著抑制siRNA-TRIM11组乳腺癌细胞增殖数量(P<0.001)(图2C)。与siRNA对照组比较，在转染6 d后siRNA-TRIM11显著抑制MCF7细胞增殖活力(P<0.05) (图2D)，siRNA-TRIM11能够显著抑制MCF7细胞侵袭(P<0.001)(图2E，F)。

2.3 miR- 24- 3p是TRIM11靶基因抑制乳腺癌细胞增殖和侵袭

探讨TRIM11潜在的靶点miRNA，该研究应用TargetScan软件检测发现miR- 24- 3p通过3′-UTR区域直接靶向TRIM11，确定miR- 24- 3p为TRIM11靶向miRNA(图3A)。我们构建了含有野生型或突变TRIM11 3′-UTR序列靶位点荧光素酶报告基因载体验证miR- 24- 3p是TRIM11的直接靶基因。荧光素酶报告检测表明miR- 24- 3p高表达显著降低野生型3′-UTR TRIM11荧光素酶活性(t12=6.417，P<0.001)，但突变型3′-UTR TRIM11没有显著差异(P>0.001)(图3B)。此外，Western bolt和RT-qPCR结果表明miR- 24- 3p慢病毒转染人乳腺癌MCF7细胞后，TRIM11蛋白和mRNA表达水平较对照组显著下调 (蛋白：t12=8.165，P<0.01；mRNA：t12=11.51，P<0.001)(图3C～E)。qRT-PCR测定miR- 24- 3p mRNA在人乳腺癌MCF7细胞中的mRNA表达显著低于正常乳腺上皮HMEC-hTERT细胞(t12=4.592，P<0.001)(图3F)。相关性分析发现TRIM11 mRNA与miR- 24- 3p mRNA在MCF7细胞中表达显著负相关(r=0.302，P=0.011)(图3G)。与对照组比较，miR- 24- 3p慢病毒转染后4～6 d显著抑制MCF7细胞增殖数量(4 d：t12=4.587，P<0.01；5 d：t12=6.631，P<0.001；6 d：t12=9.557，P<0.001)(图3H)。在miR- 24- 3p慢病毒转染6 d后MCF7细胞活力较对照组显著下降 (t12=8.140，P<0.001)，Transwell结果表明miR- 24- 3p慢病毒转染能够显著抑制MCF7细胞侵袭(t12=7.542，P<0.001)(图3I, J)。

MCF7 cells were transfected with Leti-siRNA control (siRNA-control) or Leti-siRNA-TRIM11(siRNA-TRIM11)for 6 day; A, B.Knockdown efficiency of Leti-siRNA-TRIM11 in MCF7 cells was confirmed by Western blot; C.total cell numbers of MCF7 cell were counted at the indicated time points; D.at 6 d after plating, the MTT assay was performed to determine the viability of MCF7 cells; E, F.Transwell invasion assay of MCF7 cells expressing siRNA-control or siRNA-TRIM11;*P<0.01,**P<0.001 compared with siRNA-control

A.the miR- 24- 3p targeting sequence located in the 3′-UTR of TRIM11; B.dual-luciferase reporter assays were transiently transfected with the reporter plasmids with or without Leti-miR- 24- 3p; C, D.Western blot assays of the TRIM11 protein levels in MCF7 cells transfected with miR- 24- 3p or miR-control; E.the expression levels of TRIM11 mRNA in MCF7 cells were determined by RT-qPCR; F.the expression levels of miR- 24- 3p in cell samples were determined by RT-qPCR,**P<0.001 compared with HMEC-hTERT; G.spearman correlation between miR- 24- 3p and TRIM11 mRNA expression levels in MCF7 cells was analyzed; H.total cell numbers of MCF7 cell were counted at the indicated time points; I.the MTT assay was performed to determine the viability of MCF7 cells; J.Transwell invasion assay of MCF7 cells expressing miR- 24- 3p or miR-control;*P<0.01,**P<0.001 compared with miR-control

图3miR-24-3p为TRIM11靶基因，抑制乳腺癌细胞增殖和侵袭

3 讨论

TRIM家族是泛素E3连接酶家族的主要成员[11]， 在肿瘤发展和分化过程中起到关键调节作用[12]，有研究已证实[13]TRIM家族成员TRIM24是前列腺癌致癌转录激活因子，而TRIM15在人结肠腺癌中表达上调并促进肿瘤生长。其中TRIM11[4]在恶性脑胶质瘤中表达上调[5]，它促进恶性脑胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移，并通过EGFR和MAPK信号活性促进肿瘤发生发展，TRIM11也在肝癌和肺癌组织中高表达，TRIM11高表达肝癌和肺癌患者的预后较差[2, 4]，但TRIM11在乳腺癌的表达及生物学功能目前尚不明确。

本研究发现TRIM11在乳腺癌组织及MCF7细胞中表达显著增高，表明TRIM11参与乳腺癌的发生发展过程，并进一步证实了TRIM11高表达乳腺癌患者生存率显著降低，因此推测TRIM11可能是一种乳腺癌的致癌因子，TRIM11高表达具有重要的预后价值。研究证实siRNA TRIM11慢病毒有效沉默TRIM11表达，而且发现沉默TRIM11表达抑制MCF7细胞增殖数量、增殖活力和侵袭能力，反向证实了TRIM11能够通过促进乳腺癌细胞增殖和侵袭，在乳腺癌发病过程中发挥重要作用。

microRNAs(miRNAs)是非编码单链RNA分子(22个核苷酸的长度)，而在转录后水平调控基因表达结合的3′非编码区(3′-UTR)的特定基因，靶向特定基因的降解或抑制翻译[14]。miRNAs在肿瘤发展过程中发挥重要调控作用，为探讨TRIM11潜在的靶点miRNA，阐明TRIM11的促肿瘤作用机制，应用Targetscan软件和荧光素酶报告基因载体证实3′-UTR TRIM11序列相匹配miRNA为miR- 24- 3p，TRIM11可能靶向调控miR- 24- 3p表达。同时发现miR- 24- 3p抑制MCF7细胞TRIM11表达， 二者表达显著负相关，进一步证实了miR- 24- 3p是TRIM11的直接靶基因，TRIM11反向调控miR- 24- 3p发挥作用。miR- 24- 3p可作为一个独立的肿瘤抑制因子，miR- 24- 3p在膀胱癌[14]、结肠癌[6]和小细胞肺癌[8]等多种肿瘤组织中表达下调，并抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭。本研究也证实miR- 24- 3p在乳腺癌组织中表达显著下调，抑制MCF7细胞增殖数量、增殖活力和侵袭能力，这与以往miR- 24- 3p在其他肿瘤的作用相一致[15]。因此推测TRIM11靶向反向调节miR- 24- 3p信号促进肿瘤细胞增殖和侵袭，这可能是TRIM11在乳腺癌中作用机制之一。

综上所述，TRIM11在乳腺癌组织及人乳腺癌MCF7细胞中表达上调，并可能通过靶向调控miR- 24- 3p促进乳腺癌细胞增殖和侵袭，进而影响乳腺癌预后，TRIM11/ miR- 24- 3p轴有望成为治疗乳腺癌的新靶点。

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