Per2对肝癌患者预后及肝癌细胞生长和凋亡的作用

2018-03-29颜昭勇张建省张洪新

基础医学与临床 2018年4期

李波，王沈，颜昭勇，张建省，杨涛，张洪新*，袁鹏

(1.第四军医大学唐都医院疼痛科，陕西西安 710038； 2.中国人民解放军第463医院特诊科，辽宁沈阳 110042；3.空军94259部队卫生队，山东蓬莱 265600)

原发性肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是中国高发恶性肿瘤之一，虽然近年来随着以手术为主，介入治疗等多种方法为辅的综合治疗不断进步，HCC患者的整体生存时间有所增加，但其病死率仍均居高不下[1]。随着精准医疗的要求，基于肝细胞肝癌分子分型进行分类治疗成为当前HCC治疗的基本要求。大量研究表明恶性肿瘤患者的多个生物节律基因发生紊乱是常见的现象，并且这种紊乱与肿瘤的恶性生物行为密切联系[2]。Per2作为昼夜生物节律形成中的重要负性调控因子[3]，可调控多种基因的转录，是抑制肿瘤发生、进展的关键因素[4- 5]。已有研究证实Per2在卵巢癌[6]、头颈部癌[7]、慢性白血病[8]、胃癌[9]和前列腺癌[10]中表达下调，上调其表达能够显著抑制肿瘤细胞增殖。Per2在HCC中表达下调[11]，但其与HCC患者的临床病理特征、预后及在HCC细胞中的生物学功能均尚不明确。本研究探索了Per2在HCC组织中表达变化，分析其与患者预后的关系和对细胞生长的影响，以期为HCC的临床预后判断和分子靶向治疗提供实验依据和新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床标本：收集2000—2016年在唐都医院接受原发性肝细胞肝癌手术切除术标本117例，所有病例的临床资料均完整，均经病理诊断确诊为肝细胞肝癌，所用标本详细信息见表1。该研究通过唐都医院伦理委员会审核批准并取得所有涉及此项研究患者的同意。

1.1.2 细胞及主要试剂：肝癌细胞SMMC- 7721(中国科学院上海细胞库)；胎牛血清(杭州四季青公司)；RPMI1640培养基(Gibco公司)；LipofectamineTM2000(Invitrogen公司)；Per2真核表达质粒及对照组质粒(Gencopoeia公司)；兔多克隆抗体Per2(Abcam公司和武汉三鹰公司)；兔多抗β-Tubulin抗体(武汉三鹰公司)；羊抗兔二抗(上海碧云天公司)；凋亡检测试剂盒(上海贝博生物公司)；MTS试剂(Promega公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及转染：在含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，在37 ℃，5% CO2的条件下培养SMMC- 7721细胞。细胞按4×105个/孔接种于6孔板中，将Per2真核表达质粒和LipofectamineTM2000混合后加入到6孔板细胞内，转染后细胞继续培养48 h。

1.2.2 免疫组化检测：肝癌组织病理石蜡切片依序脱蜡，柠檬酸盐缓冲液进行高压抗原修复，3% H2O2溶液浸泡15 min，山羊血清28 ℃，封闭20 min。将稀释好的抗Per2多克隆抗体覆盖切片，4 ℃，过夜孵育。PBS洗涤3次后加二抗工作液，37 ℃恒温箱孵育20 min。PBS洗涤3次后加辣根过氧化物酶，28 ℃恒温箱孵育20 min。PBS摇洗3次，加入DAB显色5～8 min。苏木精复染，室温3 min，1%盐酸乙醇分化2～3 s。依序脱水、透明和封片。染色结果判读：400×视野下随机选5个不同视野。计算阳性细胞百分比：<5%为0分、5%～25%为1分、26%～50%为2分、51%～75%为3分、76%～100%为4分。细胞着色程度：未染色记为0分、浅黄色为1分、棕黄色为2分、棕褐色为3分。两个评分结果相乘得到的分数为最终该分子的染色得分。

1.2.3 Western blot检测蛋白水平：经转染48 h的Per2过表达质粒组和对照质粒组肝癌SMMC- 7721细胞，胰蛋白酶消化，裂解液裂解细胞，提取细胞蛋白。10%的SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白样品，经转膜后5%脱脂牛奶封闭1 h，加Per2的一抗，4 ℃孵育过夜。TBST漂洗3次，二抗室温孵育2 h，TBST漂洗3次，ELC显色。

1.2.4 MTS法检测细胞增殖：96孔板铺种SMMC- 7721细胞，每孔加培养基100 μL，每组设置5个复孔，同时设置只加培养基无细胞的空白对照组。96孔板每孔加20 μL的MTS试剂，细胞培养箱孵育2 h后在490 nm波长下检测细胞的吸光度值。

1.2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡：胰蛋白酶消化6孔板SMMC- 7721细胞，预冷PBS洗涤细胞2次，500 μL结合液重悬细胞，调整细胞至1×106个/mL。细胞悬液中加入5 μL的ANXA5-FITC和5 μL的PI染料，充分混匀，4℃避光孵育15 min。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 Per2在HCC组织的表达情况

117例HCC组织中，Per2表达阳性率为70.94%，显著低于对应癌旁肝组织的87.18%。癌组织中Per2染色评分为2.14±1.76，显著低于癌旁肝组织的6.39±3.84(P<0.01)(图1)。

图1 Per2在肝癌组织和癌旁组织中的表达Fig 1 Expression level of Per2 in HCC tissues and adjacent tissues(×400)

2.2 HCC患者Per2的表达高低与患者临床病理特征的相关性分析

将117例HCC患者按照Per2免疫组化评分结果分为低表达Per2组和高表达Per2组。Per2表达与HCC患者的肿瘤直径、门脉侵袭和TNM分期相关(P<0.05)(表1)。

表1 Per2表达水平与HCC患者临床特征的相关性

Abbreviations: HBsAg.hepatitis B surface antigen; AFP.α-fetoprotein; PVTT.portal vein tumor thrombosis; TNM.tumor nodes metastases.

2.3 Per2表达与肝细胞肝癌预后的关系

Per2低表达的患者总体生存期(overall survival, OS)和无复发生存期(recurrence-free survival, RFS)较Per2高表达的患者短(P<0.05)(图2)。

2.4 Per2影响肝癌SMMC- 7721细胞增殖

转染Per2真核表达质粒组Per2相对蛋白表达为2.76±0.47，显著高于转染对照质粒组Per2相对蛋白表达1.10±0.30(P<0.01)。在SMMC- 7721细胞中转染Per2真核表达质粒可满足后续细胞功能试验研究的需求(图3)。

EV.control plasmids; Per2.Per2 eukaryoticexpression plasmid图3 Western blot检测各组细胞蛋白表达Fig 3 Expression of proteins in groups were measured by Western blot

与转染对照质粒组相比，转染Per2真核表达质粒组细胞增殖显著受到抑制，转染后第3天，Per2过表达组吸光度为0.501±0.063，显著低于对照组的0.812±0.060(P<0.01)(图4)。

EV.control plasmids; Per2.Per2 eukaryotic expression plasmid; *P< 0.01 compared with EV groups图4 Per2对肝癌SMMC- 7721细胞增殖的影响Fig 4 Effect of Per2 on proliferation of SMMC- 7721

2.5 Per2对肝癌SMMC- 7721细胞凋亡分析

过表达Per2组细胞凋亡百分比为22.83±2.27，显著高于对照组的10.63±1.62(P<0.01)(图5)。

EV.control plasmids; Per2.Per2 eukaryotic expression plasmid图5 Per2对肝癌SMMC- 7721细胞凋亡的影响Fig 5 Effect of Per2 on apoptosis of SMMC- 7721 cells

3 讨论

近年来，Per2作为新的候选抑癌基因已在多种恶性肿瘤组织中被发现其表达下调，且与肿瘤进展和患者预后相关。在本研究117例肝癌病例中，癌组织Per2表达阳性率显著低于癌旁肝组织中表达阳性率，而Per2免疫组化评分癌组织中Per2染色评分仅为癌旁肝组织Per2染色评分的30%。同时本研究在4个肝癌公共数据(GSE14520、GSE22058、GSE25097、TCGA)共计622例HCC中发现，癌组织中Per2的mRNA表达同样显著降低(结果未展示)。该结果与既往Per2在其他肿瘤中的表达情况相一致，也与在中国台湾地区46例HCC患者和贵阳地区40例HCC患者中Per2在癌组织中表达水平显著下降的结果一致[11- 12]。

目前临床缺乏早期诊断HCC和HCC完全切除术后判断预后的有效生物学指标，造成患者在就诊时已处于中晚期，而在手术后肿瘤易复发和转移。因此，寻找有效反映HCC复发、转移的分子标志物成为精准医疗的当务之急。本研究发现Per2表达与肿瘤直径、门脉侵袭和TNM分期等因素相关，Per2低表达的患者总体生存期和无复发生存期均较Per2高表达的患者短。上述结果表明Per2有望作为肝癌独立预后判断指标，下一步需扩大病例样本进行验证。

目前对于Per2发挥抑癌作用及机制尚未完全清楚。研究显示，Per2参与包括细胞增殖、周期、凋亡和转移等多项调控，如前列腺癌细胞中过表达Per2会抑制细胞增殖和存活[10]。口腔磷状癌细胞中干涉Per2，细胞周期相关分子cyclinA2、cyclinB1、cyclinD1、CDK4、CDK6和E2F1增加，而p53、p16和p21减少，G1/G0期细胞减少，细胞凋亡减少[13]。在X线诱导U343胶质瘤细胞DNA凋亡模型中，干涉Per2会减少DNA损伤和细胞死亡，Per2通过增加P53活性和表达来抑制肿瘤细胞增殖、DNA损伤修复及增加凋亡[4]。乳腺癌中Per2缺失会增强EMT及相关蛋白表达[14]。本研究中过表达Per2会显著抑制肝癌SMMC- 7721细胞增殖和促进细胞凋亡，这与Per2表达和HCC患者肿瘤直径成负相关性二者较一致。

下一步研究需深入探讨Per2抑制HCC细胞增殖的具体分子机制，从而为以Per2为靶标的肝癌早期诊断、术后复发监测以及分子靶向治疗提供新的理论支持。

[1] Budny A, Kozlowski P, Kaminska M,etal. Epidemiology and risk factors of hepatocellular carcinoma [J]. Pol Merkur Lekarski, 2017, 43: 133- 139.

[2] Shostak A. Circadian clock, cell division, and cancer: from molecules to organism [J]. Int J Mol Sci, 2017, 18: 873- 888.

[3] Sahar S, Sassone-Corsi P. Metabolism and cancer: the circadian clock connection [J]. Nat Rev Cancer, 2009, 9: 886- 896.

[4] Niu ZF, Wang CQ, Xia HC,etal. Period2 down-regulation inhibits glioma cell apoptosis by activating the MDM2-TP53 pathway [J]. Oncotarget, 2016, 7: 27350- 27362.

[5] Lee S, Donehower Lawrence A, Herron Alan J,etal. Disrupting circadian homeostasis of sympathetic signaling promotes tumor development in mice [J]. PLoS One, 2010, 5: e10995. doi: 10.1371./journal.pone.0010995.

[6] Tokunaga H, Takebayashi Y, Utsunomiya H,etal. Clinicopathological significance of circadian rhythm-related gene expression levels in patients with epithelial ovarian cancer [J]. Acta Obstet Gynecol Scand, 2008, 87: 1060- 1070.

[7] Hsu CM, Lin SF, Lu CT,etal. Altered expression of circadian clock genes in head and neck squamous cell carcinoma [J]. Tumour Biol, 2012, 33: 149- 155.

[8] Yang MY, Chang JG, Lin PM,etal. Downregulation of circadian clock genes in chronic myeloid leukemia: alternative methylation pattern of hPER3 [J]. Cancer Sci, 2006, 97: 1298- 1307.

[9] Zhao H, Zeng ZL, Yang J,etal. Prognostic relevance of Period1 (Per1) and Period2 (Per2) expression in human gastric cancer [J]. Int J Clin Exp Pathol, 2014, 7: 619- 630.

[10] Jung-Hynes B, Huang W, Reiter Reiter J,etal. Melato-nin resynchronizes dysregulated circadian rhythm circuitry in human prostate cancer cells [J]. J Pineal Res, 2010, 49: 60- 68.

[11] Lin YM, Chang JH, Yeh KT,etal. Disturbance of circadian gene expression in hepatocellular carcinoma [J]. Mol Carcinog, 2008, 47: 925- 933.

[12] Yang SL, Yu C, Jiang JX,etal. Hepatitis B virus X protein disrupts the balance of the expression of circadian rhythm genes in hepatocellular carcinoma [J]. Oncol Lett, 2014, 8: 2715- 2720.

[13] Wang QQ, Ao YR, Yang K,etal. Circadian clock gene Per2 plays an important role in cell proliferation, apopto-sis and cell cycle progression in human oral squamous cell carcinoma [J]. Oncol Rep, 2016, 35: 3387- 3394.

[14] Hwang-Verslues WW, Chang PH, Jeng YM,etal. Loss of corepressor PER2 under hypoxia up-regulates OCT1-mediated EMT gene expression and enhances tumor malignancy [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013, 110: 12331- 12336.

新闻点击

睡眠呼吸暂停面罩无法遏止心脏病风险

据美国WebMD医学新闻网(2016- 09- 04)报道，由于阻塞性睡眠呼吸暂停而造成的晚上呼吸困难曾长期被认为是心血管风险增加的原因。然而，最近的一篇研究让人们对这个关联性产生困惑。用持续性正压呼吸器(CPAP)治疗可以减轻睡眠呼吸暂停的症状，但它无法降低使用者长期的心脏病发作、脑卒中或心脏相关死亡的概率。

CPAP是持续性正压呼吸器，使用者在晚上睡觉时戴上它，让他们呼吸较为顺畅。

然而，CPAP疗法难以坚持，据这篇研究报道，人们每晚使用CPAP的时间平均只有3 h。

研究结果显示，无论是否使用CPAP，心脏相关死亡、心脏病发作、脑卒中、短暂缺血性发作等的发病率并没有差异。

为何CPAP对心脏健康没有益处？Doug McEvoy博士认为，以前的观察性研究可能高估了睡眠呼吸暂停与心血管疾病之间的关联，如果这个关联性比想象的弱，那么阻断睡眠呼吸暂停对心脏的益处就不会那么大了。

McEvoy博士认为，出现这个研究结果的原因还可能是因为有许多参与者每晚只使用CPAP 3 h，或许还没有长到足以带给心脏益处。

吸烟与克隆病术后复发风险有关

据美国WebMD医学新闻网(2016- 09- 09)报道，有新的研究显示，吸烟增加了克隆病患者肠手术后的复发风险。

这篇研究包括了英国240名克隆病患者，于他们进行肠手术后追踪3年；研究者指出，克隆病发生于免疫系统攻击肠道内膜，引起严重炎性反应，可能会导致腹泻、腹痛、恶心与食欲降低。

一开始通常会使用抑制免疫系统的药物治疗这类患者，但是，研究人员认为，超过半数的克隆病患者最后进行了手术移除受感染的肠段，然而，手术无法根治克隆病，常会复发。

爱丁堡大学的研究者认为，吸烟者比不吸烟者更容易在术后复发。

研究者还评估了称为硫嘌呤的这类药物(如mercaptopurine，商品名 Purinethol与Purixan)是否可有效预防术后复发。研究发现，这类常被用于治疗克隆病的药物确实可降低吸烟者的复发风险，但是不适用于非吸烟者。

研究人员认为，研究结果提示吸烟的克隆病患者在术后应立即给予硫嘌呤类药物，但对于非吸烟者并无证据支持使用这些药物。