先天性白内障Rncat小鼠行为学检测与分析

张 燕，王 莹，马 嵋，燕顺生，陈欣如*

(1.新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心，乌鲁木齐 830002； 2.新疆医科大学第一附属医院人类疾病动物模型研究实验室，乌鲁木齐 830054)

动物行为学是科研工作者评价实验动物状态的重要指标，通过观察检测记录动物自主活动(旷场实验)、协调运动(足迹分析、衣架实验、网屏实验、滚轴实验等)、学习和记忆力(高架十字迷宫实验)等方面的行为学实验，评价实验动物运动功能、神经功能[1]和肌肉发育等整体状态[2]。新疆实验动物研究中心挑选发生CRYGS基因突变的KM小鼠，经过十余年的选种育种，采取全同胞兄妹交配方式，建立了先天性白内障小鼠模型，并联合中科院上海生物工程研究中心进行品系的鉴定及实验动物检测，正式将其命名为Rncat小鼠[3]。本文以Rncat小鼠的近交后代和随机交配后代为研究对象，观察记录其在自主活动度、协调运动、体能检测和激惹度检测等方面的各项指标，为其在毒理学、药理学、神经学等学科的应用提供基础实验数据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

1.1.1 实验动物分组

所有实验动物均由新疆实验动物研究中心提供[SCXK (新) 2016-0001]，实验在新疆实验动物研究中心SPF级实验室内进行[SYXK (新) 2015-0001]。实验组一的先天性白内障Rncat小鼠全部是Rncat小鼠全同胞兄妹近亲交配后生产的小鼠，雌雄各半共40只，1.5月龄，体重为17～21 g。实验组二的Rncat小鼠是来源于近亲交配Rncat小鼠的血缘扩大群，经过5代随机交配后生产的小鼠，雌雄各半共40只，1.5月龄，体重为17～22 g。实验组三为BALB/c小鼠，雌雄各半共40只，1.5月龄，体重为16～20 g。实验组四为KM小鼠，雌雄各半共40只，1.5月龄，体重为18～22 g。

1.1.2 动物实验的环境及操作控制

实验室温度保持在20℃～24℃，相对湿度30%～50%，实验定时开始于每天10～13时。实验前一周，每天捉放抚摸实验小鼠，让其适应实验人员的移动及触碰方式。实验开始前，将各待测小鼠分笼饲养一夜，确保小鼠正常饮食体能充沛。操作人员确定不变，实验时身穿白色隔离服，戴一次性口罩和手套。各项实验每只小鼠测定前，实验人员手套及各项实验用具均用45%浓度酒精擦拭，待气味完全挥发后，再进行下一只小鼠的实验。这些环境、人员及操作的控制是为了最大程度减少因人员变动、操作手法、动物气味残留等因素引起动物实验数据的改变，实验期间遵守3R原则，给予实验动物人道关怀处理。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠自主活动度检测：旷场实验[4]

实验室自制长宽高分别为50 cm×50 cm×40 cm的旷场实验箱，将实验箱内部涂成黑色，将箱底正方形平均分为16小格，沿箱壁的12方格记为外周格，中心4小格为中央格。箱体正上方连接视频记录系统。实验动物初始被放在中央格，记录实验5 min之内实验动物对各区域的探索表现。

1.2.2 小鼠协调运动度检测：衣架实验[5]

首先自制衣架状器械，水平为长40 cm、直径3 mm的细园杆，悬挂至距离实验台高约40 cm的半空。实验动物初始时帮助小鼠以前爪抓住水平杆中部，同时开始计时观察30 s。计分标准参照[6]：小鼠10 s内从水平杆上掉落记为零分，小鼠前爪能抓住水平杆记为1分，小鼠尝试攀爬水平杆记为2分，小鼠的3只爪子能抓住水平杆记为3分，小鼠4只爪子抓住水平杆并且尾巴缠绕在水平杆上记为4分，小鼠在水平杆上行走并尝试在水平杆末端停留记为5分。记录小鼠从水平杆上掉落的时间或在水平杆末端的停留时间。

1.2.3 小鼠体能检测：强迫游泳实验[7]

用有机玻璃自制长宽高为30 cm×30 cm×20 cm的小鼠游泳盒，水深约10 cm，水温保持在21℃～23℃，强迫每只小鼠游泳6 min后观察记录小鼠接下来4 min内小鼠累计不动时间。

1.2.4 小鼠激惹度检测：悬尾实验[8]

将小鼠尾部(距尾尖约1.5 cm)用医用胶布固定在水平木板上，小鼠头部距离实验台约10 cm左右，小鼠保持倒悬状态2 min后，连续观察4 min内实验小鼠倒悬活动状态，记录小鼠身体下垂、完全不动的总时间。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 旷场实验结果

各组小鼠在旷场实验的表现中，组一小鼠在中央格、外周格的停留时间为(8135.44±3264.15) s、(287998.10±3045.52) s，与组二小鼠停留时间(8023.18±3427.26) s、(287864.32±2999.61) s相比差异无显著性，与组三小鼠停留时间(6182.69±3105.33) s、(289356.75±3112.85) s，组四小鼠停留时间(7471.56±2990.97) s、(289047.65±3013.74) s相比差异有显著性(P< 0.01)。在实验中，组一小鼠移动格子(188.04±17.46)次、站立(40.02±3.85)次，与组二小鼠(183.12±19.10)次、(39.13±3.72)次相比差异无显著性，与组三小鼠(125.75±14.28)次、(31.64±6.37)次，组四小鼠(138.74±12.31)次、(32.23±6.69)次相比各项数值差异有显著性(P< 0.01)。各组小鼠实验结果详见表1。

Tab.1Results of open field test in the mice

组别Groups中央格停留时间(ms)Residencetimeinthecentralgrid外周格停留时间(ms)Residencetimeintheperipherygrid移动格子数Timesofgridambulation站立次数Stand⁃uptimes组一Group1813544±32641528799810±30455218804±17464002±385组二Group2802318±34272628786432±29996118312±19103913±372组三Group3618269±310533∗∗28935675±311285∗∗12575±1428∗∗3164±637∗∗组四Group4747156±299097∗∗28904765±301374∗∗13874±1231∗∗3223±669∗∗

注：与组一相比，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with the group 1,*P< 0.05,**P< 0.01.

Tab.2Results of coat-hanger test in the mice

组别Groups实验得分Scores在水平杆末端停留时间(s)Residencetimeattheendofthehorizontalbar从水平杆上掉落的时间(s)Latencytimeoffallingfromthehorizontalbar组一Group146±034165±458183±301组二Group247±057168±503198±276组三Group345±092∗160±622∗174±313∗组四Group448±038169±564198±289

注：与组一相比，*P< 0.05。

Note. Compared with the group 1,*P< 0.05.

2.2 衣架实验结果

在衣架实验中，组一小鼠实验得分为(4.6±0.34)，与组三小鼠得分(4.5±0.92)相比差异有显著性(P< 0.05)；组一小鼠在水平杆末端停留时间为(16.5±4.5) s，与组三(16.0±6.22) s相比差异有显著性(P< 0.05)；组一小鼠从水平杆上掉落的时间(18.3±3.01) s，组三小鼠(17.4±3.13) s，两组数据相比差异有显著性(P< 0.05)。组一小鼠各项结果与组二、组四小鼠相比差异无显著性。详见表2。

2.3 强迫游泳实验结果

强迫游泳实验中，组一小鼠的累计不动时间最短，为(137.38±10.66) s，组二小鼠与其相比时间稍长(140.43±11.24) s但差异无显著性，组三、组四小鼠的累计不动时间明显长于组一，分别是(171.63±16.75) s和(182.62±12.53) s，与组一相比差异有显著性(P< 0.01)。详见表3。

2.4 悬尾实验结果

各组实验小鼠悬尾实验结果见表4。组一小鼠在悬尾实验中，累计不动时间是(104.83±11.22) s，与组二小鼠的累计不动时间(115.29±9.76) s相比差异无显著性，与组三、组四小鼠累计不动时间相比差异有显著性(P< 0.01)。详见表4。

3 讨论

先天性白内障Rncat小鼠，是以KM小鼠的基因突变小鼠为亲本，经过新疆实验动物研究中心十年以上的近交选育，建立的先天性白内障模型小鼠。作者在十余年的饲养过程中发现，无论是以近交繁殖或者是随机交配繁殖的方式，该种群小鼠均能很好地保持其先天性白内障特质。

Tab.3Results of forced swimming test in the mice

组别Groups累计不动时间(s)Immobilitytime组一Group113738±1066组二Group214043±1124组三Group317163±1675∗∗组四Group418262±1253∗∗

注：与组一相比，**P< 0.01。

Note. Compared with the group 1,**P< 0.01.

Tab.4Results of tail suspension test in the mice

组别Groups累计不动时间(s)Immobilitytime组一Group110483±11．22组二Group211529±9．76组三Group315542±12．58∗∗组四Group416063±12．69∗∗

注：与组一相比，**P< 0.01。

Note. Compared with the group 1,**P< 0.01.

本实验通过对先天性白内障Rncat小鼠进行行为学检测，对比同月龄的Rncat小鼠与正常的近交系BALB/c小鼠及KM小鼠在自主活动度、协调运动、体能和激惹度等方面的行为数据，检测到Rncat小鼠在行为学上与其他近交系或封闭群小鼠的不同，这些数据的差异，可能与实验小鼠月龄相同但体重差异有关，也可能与白内障小鼠病理改变导致的行为学改变有关。

旷场实验用于评价实验动物在新环境的自主活动度与紧张度，以小鼠的水平活动次数评价小鼠活动的强弱。此次旷场实验中，在相同的环境条件下，Rncat小鼠在中央格停留的时间和穿越格子的次数明显高于其他小鼠，客观地反映Rncat小鼠的自主活动量高于其他小鼠，可能因为该小鼠先天性白内障病理学改变，引起的焦虑相关行为学变化。此次实验中所有小鼠在四周格的时间明显高于其在中央格的时间，这可能与小鼠对空旷环境的恐惧感及沿壁活动的天性有关。

衣架实验主要评价小鼠脑对肢体的肌力和协调的控制功能[9]，强迫游泳实验直接用于测试小鼠体能，同时也反映小鼠在强迫游泳实验时，产生“行为绝望”的表现[10]。此次实验中Rncat小鼠与KM小鼠在衣架实验及强迫游泳实验中结果相近，但与BALB/c小鼠差异有显著性，可能是由于Rncat小鼠来源于KM小鼠，相同月龄小鼠脑对肢体的控制和体能等表现相似，而由于BALB/c小鼠的近交繁殖特性导致其体形较小、体能较弱，所以其与Rncat小鼠及KM小鼠在衣架实验中结果相比差异有显著性。

悬尾实验则反映实验动物激惹程度，该项实验评价指标为累计不动时间，实验结果显示Rncat小鼠与BALB/c小鼠或KM小鼠相比，累计不动时间短，为Rncat小鼠可能成为小鼠绝望模型的实验动物提供科学数据基础。

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