树鼩腺病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

宋庆凯，李晓飞，苗雨润，张志成，王 璇，袁 圆，代解杰，孙晓梅

(中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心，云南省重大传染病疫苗研发重点实验室，中国医学科学院医学生物学研究所实验树鼩标准化与应用研究省创新团队，昆明 650118)

树鼩(Tupaiabelangeri)作为与灵长类动物亲缘关系最近的新型模式动物，在人类疾病模型尤其是感染性疾病模型研究中发挥着不可或缺的作用，已逐步成为生物医学研究的热点[1]。前期开展的相关研究表明，野生来源树鼩中腺病毒携带率较高，并有疑似病例发生，被列为树鼩实验动物微生物质量控制的检测指标之一。因此，建立一种高效、快速，可反应个体病毒载量的实时荧光定量PCR方法势在必行。

树鼩腺病毒(tree shrew adenovirus，TAV)属于腺病毒科，哺乳动物腺病毒属。迄今，已发现有100多种腺病毒能感染人、哺乳动物和禽类。腺病毒感染会引起急性上呼吸道感染、急性眼结膜炎、急性出血性膀胱炎、腹泻等疾病[2]。目前，在树鼩腺病毒(TAV)检测方面，已有普通PCR方法报道[3]，但此类方法只可用于TAV定性检测且灵敏度低。本研究根据TAV的3’保守区域设计特异性引物，通用性好，稳定性高，适用于不同型别病毒株检测，建立了操作简便、敏感性高、特异性强、重复性好、可实时定量分析TAV感染程度的TaqMan实时荧光定量PCR方法[4-8]，以期为TAV的分子流行病学调查和早期感染研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物

野生来源成年树鼩，性别不限，在普通级环境设施中仅饲养了3个月，体重120～150 g。饲养环境：温度18℃～28℃，相对湿度30%～60%，噪音≤ 60 dB，光照强度100～150 lx。实验动物来源于医学生物学研究所树鼩种质资源中心[SCXK (滇) K2013-0001]，实验操作在医学生物学研究所树鼩种质资源中心实验设施进行[SYXK (滇) K2013-0001]。

1.2 主要试剂与仪器

Viral DNA Kit(购自Omega)，iTaqTMUniversal Probes One-Step Kit(购自Bio-Rad)。CFX96TM荧光定量PCR仪(Bio-Rad)，核酸蛋白检测仪，Vortex QL-902，制冷机(雪科)，台式微量高速离心机，恒温水浴锅，离心管。

1.3 实验方法

1.3.1 样本来源及DNA提取

树鼩腺病毒、树鼩呼肠孤病毒、EV71、人单纯疱疹病毒1型来自本实验室保存。使用Viral DNA Kit提取病毒DNA。详细操作根据产品说明书进行。

1.3.2 TaqMan实时荧光定量PCR的建立

(1)引物设计合成：从NCBI中检索获得TAV的全基因组，利用DNA Star软件设计扩增病毒株3’保守区域(22 989 bp～23 476 bp)特异性引物，引物序列为：TAVF：5’-AAAGAATGCCCACCTCCCAT-3’和TAVR：5’-CAGTGGCAGGCCATTAAGC-3’，扩增的目的片段为122 bp。根据测序所得目的基因序列设计荧光探针引物：5’-Fam-CTCGCCGCCGC CGGTTTCAC-Tamra-3’。委托昆明硕擎生物科技有限公司合成。

(2)阳性标准品的构建：以本实验室保存的阳性TAV DNA作为模板，进行目的基因片段扩增。反应体系：金牌Mix(green)20 μL，10 μM TAVF 1 μL，10 μM TAVR 1 μL，DNA模板3 μL，终体积25 μL。试剂盒参考退火温度为55℃～60℃，优化后的反应条件：98℃ 2 min；98℃ 10 s，58℃ 15 s，72℃ 15 s，共35个循环；72℃ 5 min。扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定；胶回收纯化；将目的基因片段与PUC57载体进行连接；连接后产物转化DH5α感受态细胞；测序验证。采用紫外分光光度计测定A260/280数值，计算质粒浓度，将其换算为质粒拷贝数[每微升拷贝数=质粒浓度×(6.02×1023)×(A260/280×10-9)/(DNA碱基数×660)]，式中，A260/280单位为ng/μL。

(3)绘制标准曲线：将(2)中的质粒标准品10倍倍比稀释至每微升101拷贝。用梯度稀释的标准品作为模板，进行扩增。以每微升108～101拷贝共8个梯度标准品建立标准曲线，设置复孔及阴性对照。扩增体系(20 μL)：2×iTaqTMUniversal Probes One-Step Reaction Mix 10 μL，10 μM TAVF 1 μL，10 μM TAVR 1 μL，10 μM探针引物2 μL，标准DNA模板3 μL，Easy Dilution 3 μL。优化后的扩增条件为：95℃ 2 min，95℃ 10 s，58℃ 30 s，共40个循环。通过软件自动绘制出标准曲线。

(4)灵敏性检测：以(3)中梯度稀释的质粒标准品为模板，进行TaqMan实时荧光定量PCR扩增反应，检测试验的灵敏性。

(5)重复性及特异性检测：用梯度稀释的质粒标准品作为模板，每个标准品做3个平行管，通过计算Ct均值、变异系数(即相对标准差：指标准差除以平均值，以百分数表示)分析试验的重复性。以树鼩呼肠孤病毒、EV71、人单纯疱疹病毒1型、TAV作为样品，测定TaqMan实时荧光定量PCR特异性。

1.3.3 TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的初步应用

采取48份人工饲养3个月野生来源树鼩粪便，并用Viral DNA Kit提取DNA作为模板，进行荧光定量PCR检测。

2 结果

2.1 目的片段的鉴定

重组质粒用PvuII酶切，结果见图1A，酶切后获得两个片段，长度相加即为质粒及插入片段大小。对重组质粒标准品进行PCR鉴定，扩增获得一条约122 bp的特异片段，结果见图1B，与预期扩增结果相符。对目的基因片段进行测序分析，NCBI比对结果同TAV 3’保守区域(22 989 bp～23 476 bp)序列完全一致，表明目的基因片段已成功接入载体中。

注：从左到右标准品拷贝数依次为：每微升3.7×101，3.7×102，3.7×103，3.7×104，3.7×105，3.7×106，3.7×107，3.7×108拷贝。图中“○”代表标准品。图2 不同稀释度阳性质粒扩增形成的标准曲线Note. The number of copies of the standard from left to right is: 3.7×101, 3.7×102, 3.7×103, 3.7×104, 3.7×105, 3.7×106, 3.7×107, 3.7×108 copies per microliter, respectively. “○”represents standard values.Fig.2 Standard curve of plasmid DNA in different dilutions

注：A：M：1 kb DNA marker，1：酶切后的PUC57重组质粒；B：M：500 bp DNA marker，1：重组质粒PCR产物。图1 目的片段的扩增Note. A: M: 1 kb DNA marker; 1: PUC57 recombinant plasmid after digestion. B: M: 500 bp DNA marker; 1: PCR product of recombinant plasmid.Fig.1 Amplification of target fragment

2.2 TaqMan实时荧光定量PCR标准曲线

重组质粒标准品经核酸分析仪检测结果：A260/280值为1.93，浓度为50 ng/μL，即拷贝数为每微升3.7×109拷贝。以10倍梯度稀释的重组质粒标准品为模板进行扩增，绘制标准曲线(图2)，相关系数R2为0.998，扩增效率为95.7%，以起始模板量的对数值为X轴，循环数(Ct值)为Y轴做回归曲线，即标准曲线(Y=-3.430lgX+ 37.951)，具有良好的线性关系。

2.3 TaqMan实时荧光定量PCR灵敏性

灵敏性检测试验扩增结果如图3，1～8为不同稀释浓度的阳性质粒，当阳性质粒拷贝数为每微升3.7拷贝，才出现特异性扩增曲线且阴性对照无特异性扩增，表明该方法的最低检测灵敏度可达每微升3.7拷贝。

2.4 TaqMan实时荧光定量PCR重复性

分别以每微升3.7×105、3.7×106和3.7×107拷贝的重组质粒标准品为模板进行扩增，每份标准品设置3个平行管，通过计算Ct值的变异系数对试验重复性进行评价，结果详见表1，变异系数不足0.5%。

2.5 TaqMan实时荧光定量PCR特异性

特异性试验检测结果(图4)显示，在40个反应循环内，以每微升3.7×106拷贝的质粒标准品和TAV为模板的PCR反应有特异性扩增曲线。以树鼩呼肠孤病毒、EV71、人单纯疱疹病毒1型为模板的PCR反应均无扩增曲线。表明建立的基于TaqMan探针实时荧光定量PCR方法具有高度特异性。

注：1～8：每微升3.7×107，3.7×106，3.7×105，3.7×104，3.7×103，3.7×102，3.7×101，3.7×100拷贝；9：阴性对照。图3 TaqMan实时荧光定量PCR灵敏性检测结果Note. 1-8: 3.7×107, 3.7×106, 3.7×105, 3.7×104, 3.7×103, 3.7×102, 3.7×101, 3.7×100 copies per μL, respectively; 9: Negative control.Fig.3 Sensitivity of the TaqMan real-time fluorescence quantitative PCR

每微升拷贝数CopiespermicroliterCt值 Ctvalue123 平均Ct值AverageofCtvalue变异系数(%)Coefficientofvariation37×107131813191321131901137×106165316571659165601837×1052001200920112007026

注：图中“其他病毒”指树鼩呼肠孤病毒、EV71、人单纯疱疹病毒1型。图4 TaqMan实时荧光定量PCR特异性检测结果Note. “Other viruses” in the figure are tree shrew reovirus, EV71, human herpes simplex virus type 1.Fig.4 Specific test results of the TaqMan real-time fluorescence quantitative PCR

2.6 TaqMan实时荧光定量PCR初步应用

如图5所示，在反应的35个循环内，48份样品中有19份阳性，阳性率为39.58%，最低检出浓度为每微升3.92拷贝。传统方法检测阳性率仅为25%(12/48)。因此，建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法更加灵敏且高效，可更好地运用于树鼩腺病毒的检测，为其防控提供更精准的检测方法。

图5 初步应用检测结果Fig.5 Preliminary application of the TaqMan real-time fluorescence quantitative PCR

3 讨论

树鼩腺病毒是无囊膜线性单分子双股DNA病毒，归类于腺病毒科哺乳动物腺病毒属。在前期饲养观察中，发现该病毒可普遍感染树鼩并引起急性上呼吸道感染、急性眼结膜炎、急性出血性膀胱炎、腹泻等多种疾病。Darai等早在1980年报道，在38份树鼩肾组织培养物中分离获得1株TAV[9-10]，病毒可凝集大鼠及人“O”型红细胞。陈元鼎等[11]1987年报道，在90份成年云南源树鼩大便中检测到12份腺病毒阳性，阳性率为3%。吴小闲等[12]1990年报道，从云南野生树鼩咽拭子、肾细胞培养物和粪便中分离到10株TAV，并鉴定为2个血清型(TAV-1和TAV-2)。王淑菁等[3]建立了树鼩腺病毒PCR检测方法，检测了56份刚从野外捕获来源的树鼩粪便DNA，有24份阳性，检出的阳性率达到42.85%，结果显示野生树鼩具有较高的携带率。

迄今，在腺病毒检测方面已有多种方法。其中，间接免疫荧光检测方法适用于细胞培养物中TAV的检测；ELISA检测方法主要适用于对TAV抗体的筛查，其缺点是检测结果假阳性偏高；PCR检测法具有快速方便、灵敏性好、特异性强等特点，其中实时荧光定量PCR[13-14]方法与传统PCR方法比较又具有更大的优势，最大的优势是可实时检测反应早期到终点过程中PCR的扩增情况，此外还具有灵敏性好、所需样品少、特异性强、可精确进行定量分析等特点，被认为是病原学检测的金标准。

本研究根据TAV的3’保守区域设计特异性扩增引物[15-17]，采用传统PCR方法扩增目的片段并胶回收纯化连接载体，构建出重组质粒标准品，并探索优化反应条件及扩增体系，成功建立了高效、特异、灵敏性强的TAV TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。重复性检测试验中以3个梯度标准品进行3次重复，变异系数检测结果均小于0.05%，即试验重复性好。采用此方法检测树鼩源呼肠孤病毒以及其他引起腹泻、急性眼结膜炎等疾病的病毒均无交叉反应，表明建立的检测方法具有良好的特异性。研究中应用此方法检测人工饲养3个月的野生来源树鼩TAV携带情况，检测结果显示，此方法可定性及定量分析不同个体病毒载量情况，灵敏度高，在35个循环内最低检测限度达每微升3.92拷贝。阳性检出率为39.58%，略低于王淑菁等[3]报道的野生源树鼩病毒检测结果，原因可能与样品来源有关。

本研究建立的基于TAV的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法具有高效、灵敏度高、特异性和重复性好的优点，既可定性分析又可定量分析[18]。该检测方法的构建为TAV的致病[19]、溶瘤[20]机理研究提供了详细可靠的技术支持，同时也对TAV防控具有重要作用。

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