灭活仙台病毒体内外诱导顺铂耐药性肺腺癌A549/DDP细胞凋亡

陈则东，沈晓鹏，穆洪云，张 泉

(1.江苏农牧科技职业学院，江苏 泰州 225300； 2.扬州大学兽医学院，江苏 扬州 225000)

溶瘤病毒因其杀死肿瘤细胞的能力而被广泛用于肿瘤治疗研究中，一些天然的溶瘤病毒(包括新城疫病毒、腮腺炎病毒、呼肠孤病毒和麻疹病毒)在试验阶段和临床阶段都表现出光明的前景[1-4]。目前使用的病毒选择性地在肿瘤细胞内复制而导致细胞死亡。然而，因为它们仍然存在于正常的组织中，这种活病毒感染对于癌症患者是一个安全威胁，除非它们的基因组不完整[5]。而且，宿主的抗病毒免疫可能会限制肿瘤细胞内的溶瘤病毒的复制，减弱病毒的杀伤能力。近来，因为能诱发多种抗肿瘤免疫反应而被广泛认可[6-9]的灭活仙台病毒(HVJ-E)粒子被发现能够通过凋亡途径直接杀死人的肿瘤细胞。灭活的HVJ-E先后被报道能够诱导人的前列腺癌细胞系PC3、DU145[10-11]及小鼠黑色素瘤细胞(B16F10)的凋亡[12-13]。

肺癌是目前世界范围内癌症高死亡率的一个主要原因，尽管在过去数十年内各种治疗方法(包括化疗、放疗和手术)长足发展，五年以上生存期的患者仍不足15%[14-15]。顺铂辅助化疗极大地延长了肺癌患者的生存期，然而顺铂抵抗性成为限制其使用的主要障碍。文献报道新城疫病毒能够诱导顺铂抵抗性人肺癌细胞的凋亡，然而作为活病毒可能会对宿主产生潜在威胁，因此急需寻找一种新的治疗策略。

本实验拟将A549/DDP细胞与灭活的HVJ-E共培养，探讨其是否能在体外诱导A549/DDP细胞凋亡；将灭活的HVJ-E病毒直接注射到肿瘤内，观察其是否能在体内诱导肿瘤细胞凋亡和减缓肿瘤的生长，为进一步研究其诱导凋亡机制提供现象依据。

1 材料和方法

1.1 细胞、病毒与实验动物

人非小细胞肺癌顺铂耐药株A549/DDP购自中科院上海细胞库，顺铂耐药性A549/DDP细胞培养在含2 μg/mL顺铂(Sigma)的10% FBS 1640完全培养基以维持其抗性，在实验之前3 d将其培养在不含顺铂的1640完全培养基中；仙台病毒收自10～14日龄鸡胚的绒毛膜尿囊液，纯化、浓缩、紫外线辐照灭活(99 mJ/cm2)(参考之前文献报道，灭活仙台病毒不能正常复制，但仍保留融合能力[16])；BALB/c裸鼠由扬州大学比较医学中心提供 [SCXK (苏) 2017-0007]，5只/笼饲养在SPF环境 [SYXK (苏) 2016-0020]，自由饮水与取食，实验过程中按实验动物使用的3R原则给予人道主义关怀。

1.2 主要试剂与仪器

改良型RPMI-1640培养基(SH30809.018)与胎牛血清(MZE145)购自赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司；顺铂(P4394)购自Sigma公司；TUNEL凋亡检测试剂盒(MK1020)与DAB(AR1000)显色试剂盒购自武汉博士德生物工程公司；FITC-annexin凋亡检测试剂盒I(556547)购自BD Biosciences公司。Biosciences FACSAria流式细胞仪购自美国BD公司；独立通风笼盒(IVC)购自苏州冯氏实验动物设备有限公司；倒置荧光显微镜购自德国Leica公司；RM2235徕卡轮转切片机购自上海欧启电子科技有限公司；倒置显微镜购自日本Olympus公司。

1.3 实验方法

1.3.1 流式细胞术分析细胞凋亡

细胞凋亡使用annexin V和PI双染技术，通过流式细胞仪分析细胞膜表面磷脂酰丝氨酸重排的方法加以检测。1×105A549/DDP细胞分别接受对照或者感染复数400 MOI的灭活HVJ-E处理，每组做三个重复，分别于12 h、24 h、36 h后检测凋亡率；右下象限的细胞群(PI阴性，annexin V阳性)为早期凋亡细胞，右上象限的细胞群(PI阳性，annexin V阳性)为晚期凋亡细胞。

1.3.2 TUNEL实验

将2×106A549/DDP细胞接种到BALB/c裸鼠皮下，当肿瘤直径达到5 mm时，分别取100 μL HVJ-E溶液(内含2×1010病毒粒子)或100 μL PBS溶液对实验组与对照组进行肿瘤内注射。注射3 d以后，处死小鼠，分离肿瘤，按照石蜡切片制作程序制作切片。石蜡切片分别被用于HE染色或者TUNEL实验，操作方法如前所述[17]。TUNEL阳性细胞(棕染)被认为是凋亡细胞。

1.3.3 体内溶瘤实验

注：A：A549细胞凋亡随时间变化的流式细胞术测定结果；B：A549细胞凋亡随时间变化的统计分析图。感染复数为400 MOI。与24 h相比，**P < 0.01.图1 灭活仙台病毒体外诱导A549/DDP细胞凋亡Note. A: Apoptosis in A549 cells over time detected by flow cytometry. B: Statistics of apoptosis of A549 cells over time. MOI=400∶1. Compared with 24 h,**P < 0.01.Fig.1 Inactivated Sendai virus induces apoptosis of A549/DDP cells in vitro

取20只6周龄BALB/c裸鼠随机分成两组，每组10只(雌雄各半)，分别指定为实验组和对照组。实验组每只小鼠于背部分别接种A549/DDP细胞(2×106)与HVJ-E(2×1010病毒粒子)混合液；对照组则只接种A549/DDP细胞(2×106)。每日观察肿瘤生长情况，利用游标卡尺测量肿瘤的长和宽，并按下述公式计算肿瘤体积：肿瘤体积=长×宽2/2[12]。同时将2×106A549/DDP接种到BALB/c裸鼠皮下，当肿瘤直径达到5 mm时，分别取100 μL HVJ-E溶液(内含2×1010病毒粒子)或100 μL PBS溶液对实验组与对照组进行肿瘤内注射，连续注射三次，每次间隔2 d，首次注射后每隔5 d测量一次肿瘤体积，并绘制肿瘤生长曲线。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 灭活的HVJ-E在体外能够诱导A549/DDP细胞凋亡

为了判断灭活的仙台病毒能否在体外诱导A549/DDP细胞凋亡，1×105A549/DDP细胞分别接受对照(PBS)或者感染复数400 MOI的灭活HVJ-E处理，于12 h、24 h、36 h后收集细胞，annexin V/PI双染法分析不同感染时间下的细胞凋亡率。如图1A、1B所示，随着感染时间的递增，A549/DDP的凋亡率逐渐增加，且12 h与24 h、24 h与36 h的晚期凋亡率相比差异均有显著性(P< 0.01)。

2.2 灭活的HVJ-E对A549/DDP小鼠肺癌模型表现出良好的溶瘤作用

为了评价灭活的HVJ-E在A549/DDP小鼠肺癌模型中的溶瘤能力，BALB/c裸鼠皮下接种A549/DDP细胞，然后采用瘤内注射的方式对荷瘤小鼠接种一次灭活的HVJ-E或者PBS。3 d之后处死小鼠，通过HE染色和TUNEL实验检查肿瘤切片。HE染色显示灭活的HVJ-E处理组小鼠的肿瘤切片呈现出特征性的凋亡细胞，如染色体深染、凝集，甚至表现出镰刀状染色质固缩(图2A)。除此之外，TUNEL实验结果也显示出较多的棕染细胞(图2C)。相反，在PBS对照组中则很少出现自溶或者凋亡的细胞(图2B、2D)。

注：A：A549/DDP + HVJ-E组(HE染色)；B：A549/DDP + PBS组(HE染色)；C：A549/DDP + HVJ-E组(TUNEL染色)；D：A549/DDP + PBS组(TUNEL染色)。图2 灭活仙台病毒体内溶瘤效果(× 400)Note. A: A549/DDP + HVJ-E group, HE staining. B: A549/DDP + PBS group, HE staining. C: A549/DDP + HVJ-E group, TUNEL staining. D: A549/DDP + PBS group, TUNEL staining.Fig.2 Oncolytic effect of inactivated Sendai virus in vivo

2.3 灭活的HVJ-E对A549/DDP小鼠肺癌模型肿瘤体积-时间变化曲线的作用

将2×106A549/DDP细胞与400 MOI的灭活HVJ-E共培养，24 h后接种到裸鼠皮下，并测量肿瘤体积变化情况。如图3A所示，随着接种时间的延续，对照组肿瘤体积不断增大，在第16天时体积达到400 mm3，而实验组肿瘤体积出现增大-减小-消失的变化，由此也可说明灭活的仙台病毒能够诱导A549/DDP细胞的凋亡。

将2×106A549/DDP细胞接种到BALB/c裸鼠皮下，当肿瘤直径达到5 mm时，分别取100 μL HVJ-E溶液(内含2×1010病毒粒子)或100 μL PBS溶液对荷瘤鼠进行肿瘤内注射，连续注射三次，每次间隔2 d。使用游标卡尺测定肿瘤的长与宽，并通过公式：肿瘤体积(mm3)=长×宽2/2计算肿瘤体积。如图3B所示，与PBS对照组相比，灭活的HVJ-E具有抑制顺铂耐药性的肺腺癌细胞生长的作用，差异有显著性(P< 0.05)。

注：A：A549/DDP细胞与灭活HVJ-E共培养24 h后接种裸鼠的肿瘤体积-时间变化曲线；B：瘤内注射HVJ-E后肿瘤体积-时间变化曲线。图3 肺腺癌肿瘤体积-时间变化曲线Note. A: Tumor volume-time curves of A549/DDP cells co-cultured with inactivated HVJ-E for 24 h and then inoculated into nude mice. B: Tumor volume-time curves after intratumoral injection with HVJ-E.Fig.3 Tumor volume-time curves of lung adenocarcinoma

3 讨论

细胞凋亡是细胞活动过程中的一种重要改变，细胞凋亡的失调可破坏细胞增殖与细胞死亡之间的平衡进而诱发多种人类疾病，包括神经退行性疾病、自身免疫性疾病和许多类型的癌症等[18]。因此，细胞凋亡被广泛认为具有巨大的治疗癌症的潜能。靶向细胞凋亡也逐渐成为癌症药物发现的研究热点，通过抗肿瘤药物来诱导凋亡以抑制肿瘤细胞的增殖[19]。而固有的或获得性的耐药性严重阻碍了癌症的治疗。因此，解决耐药性造成的困扰受到越来越多的关注。

有研究发现，β-榄香烯作为天然化合物就具有广谱抗肿瘤效应，它在A549/DDP细胞中通过下调P-gp蛋白(P-gp蛋白能使抗肿瘤药物从细胞内外排，从而减少细胞内药物的累积)发挥强烈的逆转作用，从而提高肿瘤细胞对抗癌药物的化疗敏感性[20]。近年来，随着溶瘤病毒研究的不断深入，利用病毒治疗癌症已经取得巨大进步。在新城疫病毒(NDV)诱导的A549/DDP细胞凋亡的研究中，发现NDV主要通过caspase途径尤其是caspase-9途径来诱导细胞凋亡，且MAPK和AKT途径对A549/DDP的凋亡也具有一定的作用[17, 21]。然而利用活病毒治疗癌症显然对病人有一定的安全风险。

越来越多的研究表明，灭活的仙台病毒(HVJ-E)具有杀伤肿瘤细胞的潜能。HVJ-E首次被报道以剂量依赖方式在人的前列腺癌细胞株PC3和DU145中直接诱导凋亡[12-13]。进一步的研究发现，HVJ-E来源的大约300 bp的RNA片段与肿瘤细胞的选择性凋亡有关。人的RIG-I能够识别HVJ-E来源的300 bp左右的RNA片段并与IFN-β启动子相互作用，启动信号级联，促使I型IFN产生[22]。这种I型IFN通过JAK-STAT途径诱导肿瘤细胞选择性凋亡[23]。通过使用JAK-STAT抑制剂并不能完全阻止HVJ-E诱导PC3细胞的凋亡，提示I型IFN介导的JAK-STAT途径并非是HVJ-E诱导凋亡的唯一途径[12]。在小鼠黑色素瘤B16F10细胞中，HVJ-E还通过MAPK途径诱导B16F10细胞凋亡。有报道指出，HVJ-E能够通过诱导免疫反应尤其是T细胞介导的细胞毒作用选择性杀死肿瘤细胞[24]，然而BALB/c裸鼠缺乏T细胞从而排除了HVJ-E诱导T细胞介导免疫反应。本实验中，BALB/c裸鼠皮下接种A549/DDP细胞，然后采用瘤内注射的方式对荷瘤小鼠接种HVJ-E，HVJ-E表现出了良好的溶瘤作用。因此，HVJ-E所诱导的凋亡效应存在错综复杂的机制。

HVJ-E不仅可以作为载体递送抗肿瘤药物，激活抗肿瘤免疫，同时还能直接杀伤肿瘤细胞和诱导肿瘤细胞凋亡。研究清楚HVJ-E作用肿瘤细胞的机制将加深我们对HVJ-E抗肿瘤效应的认识。本次实验通过流式细胞术和组织切片TUNEL法分别证明了HVJ-E具有在体外和体内诱导顺铂耐药性A549/DDP细胞凋亡的作用，通过诱导凋亡减缓肿瘤生长，为进一步研究HVJ-E诱导顺铂耐药性A549/DDP的凋亡机制提供现象依据。

[1] Prestwich RJ, Ilett EJ, Errington F, et al. Immune-mediated antitumor activity of reovirus is required for therapy and is independent of direct viral oncolysis and replication [J]. Clin Cancer Res, 2009, 15(13): 4374-4381.

[2] Bian J, Wang K, Kong X, et al. Caspase- and p38-MAPK-dependent induction of apoptosis in A549 lung cancer cells by Newcastle disease virus [J]. Arch Virol, 2011, 156(8): 1335-1344.

[3] Sion-Vardy N, Lasarov I, Delgado B, et al. Measles virus: evidence for association with lung cancer [J]. Exp Lung Res, 2009, 35(8): 701-712.

[4] Okuno Y, Asada T, Yamanishi K, et al. Studies on the use of mumps virus for treatment of human cancer [J]. Biken J, 1978, 21(2): 37-49.

[5] Hann B, Balmain A. Replication of an E1B 55-kilodalton protein-deficient adenovirus (ONYX-015) is restored by gain-of-function rather than loss-of-function p53 mutants [J]. J Virol, 2003, 77(21): 11588-11595.

[6] Li Q, Gao JQ, Qiu LY, et al. Enhanced immune responses induced by vaccine using Sendai virosomes as carrier [J]. Int J Pharm, 2007, 329(1-2): 117-121.

[7] Kurooka M, Kaneda Y. Inactivated Sendai virus particles eradicate tumors by inducing immune responses through blocking regulatory T cells [J]. Cancer Res, 2007, 67(1): 227-236.

[8] Zhang Q, Yuan WF, Zhai GQ, et al. Inactivated Sendai virus suppresses murine melanoma growth by inducing host immune responses and down-regulating β-catenin expression [J]. Biomed Environ Sci, 2012, 25(5): 509-516.

[9] Yoneyama Y, Ueda Y, Akutsu Y, et al. Development of immunostimulatory virotherapy using non-transmissible Sendai virus-activated dendritic cells [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2007, 355(1): 129-135.

[10] Matsushima-Miyagi T, Hatano K, Nomura M, et al. TRAIL and Noxa are selectively upregulated in prostate cancer cells downstream of the RIG-I/MAVS signaling pathway by nonreplicating Sendai virus particles [J]. Clin Cancer Res, 2012, 18(22): 6271-6283.

[11] Kawaguchi Y, Miyamoto Y, Inoue T, et al. Efficient eradication of hormone-resistant human prostate cancers by inactivated Sendai virus particle [J]. Int J Cancer, 2009, 124(10): 2478-2487.

[12] Zhang Q, Xu XS, Yuan Y, et al. IPS-1 plays a dual function to directly induce apoptosis in murine melanoma cells by inactivated Sendai virus [J]. Int J Cancer, 2014, 134(1): 224-234.

[13] Gao H, Xu XS, Chen ZD, et al. Inactivated Sendai virus induces apoptosis in murine melanoma cells by IGF-1R down-regulation [J]. Biomed Environ Sci, 2013, 26(12): 998-1002.

[14] Khuri FR, Herbst RS, Fossella FV. Emerging therapies in non-small-cell lung cancer [J]. Ann Oncol, 2001, 12(6): 739-744.

[15] Vora SA, Daly BD, Blaszkowsky L, et al. High dose radiation therapy and chemotherapy as induction treatment for stage III nonsmall cell lung carcinoma [J]. Cancer, 2000, 89(9): 1946-1952.

[16] Zhang Q, Wang Z, Yuan Y, et al. Immunoadjuvant effects of hemagglutinating virus of Japan envelope (HVJ-E) on the inactivated H9 subtype avian influenza virus vaccine [J]. Vet Immunol Immunopathol, 2011, 141(1-2): 116-123.

[17] Wu Y, Zhang X, Wang X, et al. Apoptin enhances the oncolytic properties of Newcastle disease virus [J]. Intervirology, 2012, 55(4): 276-286.

[18] Elmore S. Apoptosis: a review of programmed cell death [J]. Toxicol Pathol, 2007, 35(4): 495-516.

[19] Chen J, Han H, Chen M, et al. Inactivated Sendai virus strain Tianjin induces apoptosis in human breast cancer MDA-MB-231 cells [J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2014, 15(12): 5023-5028.

[20] Yao C, Jiang J, Tu Y, et al. β-elemene reverses the drug resistance of A549/DDP lung cancer cells by activating intracellular redox system, decreasing mitochondrial membrane potential and P-glycoprotein expression, and inducing apoptosis [J]. Thorac Cancer, 2014, 5(4): 304-312.

[21] Meng S, Zhou Z, Chen F, et al. Newcastle disease virus induces apoptosis in cisplatin-resistant human lung adenocarcinoma A549 cellsinvitroandinvivo[J]. Cancer Lett, 2012, 317(1): 56-64.

[22] Liu LW, Nishikawa T, Kaneda Y. An RNA molecule derived from Sendai virus DI particles induces antitumor immunity and cancer cell-selective apoptosis [J]. Mol Ther, 2016, 24(1): 135-145.

[23] Sadler AJ, Williams BR. Interferon-inducible antiviral effectors [J]. Nat Rev Immunol, 2008, 8(7): 559-568.

[24] Kurooka M, Kaneda Y. Inactivated Sendai virus particles eradicate tumors by inducing immune responses through blocking regulatory T cells [J]. Cancer Res, 2007, 67(1): 227-236.