肺痹方对肺纤维化小鼠抗氧化作用的实验研究*

程 雪 方 泓 指导吴银根

（上海中医药大学附属龙华医院，上海 200032）

肺纤维化是一种因多种原因引起的发病机制尚不明确的肺系疾病，好发生于老年人［1］，其中位生存期为2～5年［2］。因其发病机制复杂，病程呈不可逆性进展，早期诊断困难，目前尚无有效的临床治疗药物。肺移植是目前治疗晚期肺纤维化的唯一选择，但其价格昂贵，供体稀少，不适合临床应用和推广［3］。中医古籍中没有与肺纤维化相对应的病名，现代医家根据其临床表现，将其归为“肺痹”“肺痿”“肺胀”“咳嗽”等范畴。大量的临床实践表明，中医药在防治肺纤维化方面具有很大的优势［4］。导师吴银根教授认为本病的病机是肺络痹阻，治疗应通补肺络，并创立了肺痹方［5］。本研究拟通过观察肺痹方对肺纤维化小鼠抗氧化作用的影响，初步探讨其抑制肺纤维化的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级C57BL/6雄性小鼠，体质量8～20 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号 SCXK（京）2016-0011。

1.2 试药与仪器 1）药物：肺痹方组成三棱、法半夏、生地黄、女贞子，药物饮片由上海中医药大学附属龙华医院提供，4 味药物按照 1∶1∶1∶2 的比例，加入 8 倍剂量的水煎煮1 h后过滤，药渣加入6倍的水煎煮1 h，过滤后，两煎合并，浓缩至 1、2、4 g/mL，分装后存放于4℃冰箱备用；吡非尼酮（北京康蒂尼药业有限公司生产，国药准字：H20133376，规格每粒 100 mg）；注射用盐酸博来霉素 （大连美仑生物技术有限公司生产，批号：D1221A，每瓶 50 mg）。 2）试剂：羟脯氨酸（HYP）试剂盒（货号：A030-1）、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（货号：A001-3）、还原型谷胱甘肽（GSH）试剂盒（货号：A006-2）、丙二醛（MDA）试剂盒（货号：A003-1）均购自南京建成生物工程研究所。3）仪器：电热恒温水槽（DNB-501S，上海精宏实验设备有限公司），电热恒温培养箱（DNP-9052，上海精宏实验设备有限公司），定轨振荡器（VORTEX-5，海门市其林贝尔仪器制造有限公司），显微镜（403497，上海衡洁仪器有限公司），轮转切片机（RM2235，上海涵荣医疗器械有限公司），电子分析天平（BSA-124S，赛马利斯科学仪器有限公司），酶标仪（SynergyH1MF，美国伯腾仪器有限公司），4℃冰箱（BCD-312WDBA，青岛海尔有限股份公司），-80℃冰箱（905-ults，赛墨飞世尔科技有限公司）。

1.3 分组及造模 60只小鼠按照随机数字表法分为空白对照组、模型组、吡非尼酮组、肺痹方低剂量组、肺痹方中剂量组、肺痹方高剂量组各10只。动物自由进食、饮水，喂标准颗粒饲料，室温18～22℃，饲养常规观察1周后使用。适应性喂养结束后第2日开始造模。模型组按 7.5 mg/（kg·d）腹腔注射盐酸博来霉素［6］，连续注射10 d；空白对照组小鼠腹腔注射等量生理盐水，连续注射10 d；其余各组造模方法同模型组。

1.4 给药方法 造模后第2日，根据人与动物体表面积折算的等效剂量比值计算［7］，各组予不同浓度肺痹方进行干预。低、中、高浓度剂量组分别按照人-鼠等效量的 1、2、4 倍给药。吡非尼酮组按照 51.43 mg/（kg·d）的剂量给予吡非尼酮灌胃，肺痹方低、中、高剂量组分别按照 6.43、12.86、25.72 g/（kg·d） 的剂量予肺痹方灌胃，空白对照组及模型组给予等量的生理盐水灌胃。给药时间共28 d，每周称取各组小鼠体质量。

1.5 标本采集与检测 用药28 d后，采取眼球放血处死小鼠，继之开胸，分离出小鼠的双肺，肉眼观察双肺后，取小鼠双肺，滤纸吸水称重。肺系数=肺湿重/体质量×100%。取左肺，固定于4%多聚甲醛溶液中，用于HE染色和Masson染色。肺组织病理切片根据Szapiel等［8］方法确定肺泡炎和肺纤维化的程度。取右肺中叶，在冰生理盐水中充分漂洗后，用滤纸吸干表面水分，放入冻存管中，于-80℃冰箱中保存，用于测定肺组织匀浆中的HYP、SOD、GSH、MDA水平，按试剂盒说明书操作。

1.6 统计学处理 应用SPSS18.0统计处理。计量资料以（±s）表示，多组间检验用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 小鼠一般行为及体质量监测 见表1。空白对照组活泼好动，皮毛光亮润泽，呼吸平稳，饮食如常，体质量逐日增加，无特殊不良表现。其余各组小鼠在造模后1周内，饮食和饮水量下降，小鼠精神不振，聚集成团，呼吸急促，身体颤抖，毛发耸立、凌乱、脱落，缺乏光泽，体质量逐日下降。21 d后各组小鼠的体质量进行性增加，除空白对照组外，其余各组仍有不同程度精神倦怠，呼吸喘促等症状。7 d时与空白对照组相比，各组小鼠体质量均下降（P＜0.01）；吡非尼酮组、肺痹方高剂量组与模型组相比，小鼠体质量下降明显 （P＜0.05）。14 d时，除空白对照组外，各组小鼠体质量仍逐渐下降（P＜0.01）；与肺痹方低、中、高剂量组相比，模型组小鼠体质量下降最明显 （P＜0.05或P＜0.01）；从21 d和28 d各小鼠的体质量来看，各组小鼠的体质量逐渐增加，但与正常组相比仍存在显著差异 （P＜0.05）。

表1 各组小鼠体质量、肺系数比较（±s）

表1 各组小鼠体质量、肺系数比较（±s）

与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与空白对照组比较，△△P＜0.01。

体质量（g）组 别 n 肺系数1 d 7 d 1 4 d 2 1 d 2 8 d空白对照组 1 0 2 2.9 7±0.8 9 2 4.4 1±1.1 6 2 5.7 8±1.2 9 2 6.6 2±1.6 6 2 7.7 1±1.7 8 0.9 5±0.3 3模型组 1 0吡非尼酮组 1 0 2 1.9 0±1.0 5 2 1.2 3±0.7 1△△ 1 9.0 9±0.7 7△△2 2.1 6±1.7 3 1 9.9 7±2.2 3△△*1 9.1 2±1.3 4△△2 0.6 1±2.3 7△△2 0.5 1±1.3 2△△2 1.7 5±1.9 7△△ 1.6 1±0.2 9△△2 2.3 3±1.0 9△△ 1.4 5±0.3 8△△肺痹方低剂量组 1 0 2 2.2 3±0.9 6 2 0.9 5±0.9 8△△ 2 0.2 8±0.9 4△△*2 0.9 8±1.3 9△△ 2 2.1 6±0.9 1△△ 1.5 1±0.2 9△△肺痹方中剂量组 1 0 2 2.4 3±0.8 6 2 0.6 9±1.0 9△△ 2 0.7 1±1.3 6△△**2 1.7 3±0.6 2△△ 2 2.4 2±1.5 1△△ 1.4 8±0.4 0△△肺痹方高剂量组 1 0 2 2.3 3±2.1 5 1 9.8 1±1.6 5△△*2 0.4 4±1.2 6△△*2 1.0 6±1.3 4△△ 2 2.5 7±1.3 7△△ 1.4 5±0.2 8△△

2.2 各组小鼠肺系数比较 见表1。与正常组相比，各组小鼠的肺系数明显升高（P＜0.01），模型组小鼠的肺系数升高最明显，但与用药各组相比，无显著差异（P＞0.05）。

2.3 各组小鼠组织病理学观察 见图1~图2，表2。空白对照组小鼠肺内结构清晰，肺泡间隔无增厚、纤维渗出，无炎症细胞浸润，肺泡结构存在；模型组肺泡间隔及肺泡腔有大量炎症细胞浸润，肺泡结构消失，肺泡腔及肺泡间隔大量胶原纤维渗出，出现大片融合成团的纤维灶。吡非尼酮组肺泡间隔增厚，炎症细胞少量浸润，部分肺泡结构存在，出现肺纤维灶。肺痹方低剂量组肺泡间隔及肺泡腔有炎症细胞浸润，大量胶原纤维渗出，但与模型组对比，稍减轻。肺痹方中、高剂量组肺泡结构增宽，少量的炎症细胞浸润，肺泡结构几乎无明显受损，少量肺纤维灶。

图1 各组小鼠肺组织变化（HE染色，100倍）

图2 各组小鼠肺组织变化（Masson染色，100倍）

表2 各组小鼠肺泡炎和肺纤维化程度比较（±s）

表2 各组小鼠肺泡炎和肺纤维化程度比较（±s）

组 别 n 肺泡炎级别 肺纤维化级别空白对照组 1 0 0 0模型组 1 0 ++～+++ ++～+++吡非尼酮组 1 0 +～++ +～++肺痹方低剂量组 1 0 +～+++ +～+++肺痹方中剂量组 1 0 0～++ +～++肺痹方高剂量组 1 0 0～++ 0～++

2.4 各组小鼠肺组织匀浆中HYP含量比较 见表3。各小鼠肺组织中HYP含量，模型组最高，高于其余各组。除肺痹方低剂量组外，模型组与其他各组相比，具有显著差异（P＜0.01）；与空白对照组相比，其余各组小鼠肺组织中HYP含量明显升高（P＜0.01）；吡非尼酮组小鼠组织中HYP的含量与肺痹方各组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；肺痹方低剂量组小鼠肺组织中HYP含量明显高于肺痹方高剂量组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表3 各组小鼠肺组织匀浆中HYP、SOD、GSH、MDA含量比较（±s）

表3 各组小鼠肺组织匀浆中HYP、SOD、GSH、MDA含量比较（±s）

与空白对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01； 与模型组比较，##P＜0.01；与肺痹方低剂量组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别 n空白对照组 1 0模型组 1 0吡非尼酮组 1 0 H Y P（μ g/m g） S O D（U/m g） G S H（μ m o l/g） M D A（n m o l/m g）0.8 5±0.5 7**## 1 2 2.0 9±7.1 0**## 4 8.1 8±5.3 3**## 0.5 8±0.2 0##1.8 6±0.3 2△△ 7 1.1 1±5.3 7△△** 2 6.5 2±5.6 4△△** 1.5 0±0.3 6△△1.4 2±0.4 2△△##1 0 0.3 6±4.1 9△△##* 3 9.2 1±2.0 6△△##* 0.9 1±0.0 9##肺痹方低剂量组 1 0 1.6 8±0.3 3△△ 8 7.5 6±6.9 7△△## 3 4.5 5±1.3 3△△## 1.1 2±0.2 0△#肺痹方中剂量组 1 0 1.4 5±0.3 4△△## 9 8.8 4±5.2 9△△##* 3 9.4 4±1.6 4△△##* 0.9 1±0.3 8##肺痹方高剂量组 1 0 1.3 5±0.2 8△△##*1 0 3.8 2±4.5 9△△##** 3 9.2 1±2.4 3△△##* 0.8 0±0.2 9##

2.5 各组小鼠肺组织匀浆中SOD、GSH、MDA含量比较 见表3。空白对照组小鼠肺组织SOD、GSH含量均高于其余各组 （P＜0.01）；模型组小鼠肺组织SOD、GSH含量最低（P＜0.01）；用药各组相比较，肺痹方低剂量组小鼠肺组织SOD、GSH含量均低于吡非尼酮组、肺痹方中剂量组、肺痹方高剂量组（P＜0.05或P＜0.01）。空白对照组小鼠肺组织MDA含量低于其他各组，与模型组、肺痹方低剂量组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；与吡非尼酮组、肺痹方中剂量组、肺痹方高剂量组相比，无显著差异（P＞0.05）；模型组小鼠肺组织MDA含量最高，与其余各组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。

3 讨 论

肺纤维化是一种导致肺功能进行性丧失的严重的肺间质性疾病［9］。其发病机制尚不明确，有研究表明，肺纤维化与异常相关的多个生物途径有关，如凝血级联反应、氧化-抗氧化途径、细胞凋亡、血管重生和重建［10］。近研究表明，机体氧化/抗氧化的失衡启动了肺泡炎的发生，引起中性粒细胞、肺泡巨噬细胞、淋巴细胞浸润，这样一方面加重了氧化损伤，另一方面释放各种成纤维化细胞因子，刺激形成肺纤维化［11］。而多数学者认为，肺纤维化形成过程中存在过度或抗氧化不足的现象。

到目前为止，临床上没有有效的药物治疗此病，肺移植是彻底治疗肺纤维化终末期的唯一有效手段［12］，但由于供体稀少，且价格昂贵，不利于临床上应用和推广。吡非尼酮是一种口服生物可利用的人工合成分子，具有抗炎和抗纤维化作用［13］，2008年首先在日本得到获批应用于临床治疗。吡非尼酮虽然在一定程度上减缓疾病的进展，但抗纤维化的作用不甚理想，且相伴的副作用不容忽视［14-15］。肺痹方是上海中医药大学附属龙华医院吴银根教授治疗肺纤维化的经验方，前期临床研究表明，肺痹方能够改善患者胸闷、气短、喘咳等症状，提高患者的生存质量。本实验观察肺痹方对肺纤维化小鼠抗氧化作用的影响，发现其具有抗氧化作用，能延缓肺纤维化进展。

本研究采用连续10 d腹腔注射博来霉素诱导小鼠肺纤维化形成，而博来霉素是一种具有细胞毒性的氨基糖肽类抗肿瘤抗生素复合物，其主要的副作用是肺纤维化［16］。从研究的结果看，吡非尼酮组、肺痹方低、中、高剂量组不同程度降低了小鼠的肺系数，而且随着用药天数的增加，小鼠的体质量也逐渐增加，说明上述药物不同程度的改善了小鼠肺纤维化形成，提高了肺纤维化小鼠的生存率。HYP为胶原纤维特有，能反映肺纤维化程度。本实验模型组HYP的含量明显高于其余各组，肺痹方低剂量组小鼠肺组织中HYP含量明显高于肺痹方高剂量组，差异有统计学意义（P＜0.05），提示用药组能够减少肺纤维化小鼠肺组织中HYP的过度沉积，且肺痹方高剂量效果优于低剂量。

从肺痹方对肺纤维化抗氧化作用来看，模型组小鼠SOD、GSH含量最低，肺痹方低剂量组小鼠肺组织中SOD、GSH含量均低于吡非尼酮组、肺痹方中剂量组、肺痹方高剂量组，差异具有统计学意义。而模型组小鼠肺组织中MDA含量最高，与其余各组相比，差异具有统计学意义。说明吡非尼酮组和肺痹方低、中、高剂量组对肺纤维化小鼠肺组织中抗氧化作用有一定意义。且从上述结果来看，肺痹方高剂量组明显优于其他各组。实验结果表明，肺痹方可以抗氧化、抗自由基损伤，减少肺纤维蛋白形成，从而达到抗纤维化的作用。

肺纤维化病因病机复杂，吴银根教授认为本病为“肺络阻痹”，而本病之“本”应视为肺肾气虚，通补肺络是其治则［17］，因此创立了肺痹方（三棱、法半夏、生地黄、女贞子），三棱为活血化瘀药，吴老认为对于肺络阻痹之瘀血，非三棱、莪术等破血之品不为功，但是化血之力三棱优于莪术。法半夏能燥湿化痰，消痞散结。地黄，《本经逢原》“干地黄，内专凉血滋阴，外润皮肤荣泽，病人虚而有热者宜加用之”。女贞子具有滋补肝肾，乌须明目的作用。现代药理表明，女贞子具有抗炎、抗氧化作用［18］。此方根据临床辨证组方，用药合理，以求达到治病求本之效。

综上所述，肺痹方能够抑制肺纤维化小鼠肺组织中氧化/抗氧化系统的平衡，减少氧自由基对肺组织结构的氧化损伤程度，抑制肺组织胶原蛋白的合成，从而达到抗肺纤维化的程度。

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