分析海产品中磺胺类药物残留的测定方法

秦艳芳，吴 昊

（1.长治学院师范分院，山西 长治 046000；2.山西师范大学化学与材料科学学院，山西 临汾 041004）

引言

在鱼、虾、蟹等海产品养殖期间，需要投放磺胺类药物来对细菌感染性疾病进行预防与治疗，磺胺类药物不仅能够达到良好的抗菌效果，其自身还具备价格低、毒性少的优势。不过，当磺胺类药物达到一定浓度时，仍会对人体健康造成损害，进而影响人体的造血功能，引发溶血性贫血，特别是其中磺胺二甲基嘧啶等物质，还会有潜在的致癌危险。因此，需要建立高效的测定方法来对磺胺类药物残留进行测定。当前，我国对磺胺类药物的测定方法最常见的有气相色谱法、免疫测定法、液相色谱法及气-质联用法等。不过，这些测定方法往往只能对其中的几种磺胺类药物进行检测，而磺胺类药物的种类光是较为常见的就有几十种，再加上其他种类甚至多达数千种，因此仅仅依靠这些测定方法难以适用于对磺胺类药物的测定。为此，本文提出了一种超高效的检测方法，即液相色谱-串联质谱法来对磺胺类药物残留进行测定，它不仅灵敏度高，还能对获得较高的回收率。本文便对这一测定方法进行分析，以此明确这种测定方法的应用优势。

一、测定准备工作

（一）测定材料及磺胺类药物的种类

本次测定所选取的材料是以海产品中较为典型的日本对虾、大菱鲆及三疣梭子蟹进行磺胺类药物残留的测定，这些测定材料均为市场购买，其余测定材料还包括试剂与超纯水，测定试剂包括乙酸乙酯、乙酸铵、甲醇及甲酸，其中乙酸铵为优级纯，而甲酸试剂则为色谱纯。本次测定中，液相色谱-串联质谱法需要对21种磺胺类药物残留进行测定，这21种测定磺胺类药物的种类包括：磺胺、磺胺噻唑、磺胺二甲基异恶唑、磺胺硝苯、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺醋酰、磺胺氯哒嗪、甲氧芐氨嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲基嘧啶、磺胺苯吡唑、磺胺二甲异嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺吡啶、磺胺噻唑、磺胺胍、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧嗪哒。

（二）测定仪器

该测定方法所选用的仪器有液相色谱-串联质谱仪、超声波清洗器、超纯水仪、旋转蒸发仪、氮吹仪及高速离心机。

（三）测定条件

液相色谱-串联质谱需要调整色谱与质谱，以此建立良好的测定条件，色谱条件包括对色谱柱的调整、流动相的调整、流速的调整、柱温的调整、进样量的调整及梯度洗脱程序的设定。色谱柱的宽度为2.1mm，长度为100mm，测定精度为1.7μm；流动相调整为每升乙酸铵溶液包含5摩尔0.1%体积分数的甲酸；流速调整至0.25mL/min，柱温调整到35℃，进样量调整至10μL；梯度洗脱程序的设定应根据测定时间来对甲醇体积分数、乙酸铵溶液体积分数、梯度变化曲线进行调整，如图1所示。

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质谱条件包括对电离方式及电压的调整、离子源温度的调整、脱溶剂气温度的调整、脱溶剂气流量的调整、锥孔反吹气流量的调整及其他参数的调整。其中，电离方式设定为ESI+；电离电压设定为2.8千伏；离子源温度设定为110摄氏度；脱溶剂气温度设定为350摄氏度、气流量为700升每小时；锥孔反吹气流量设定为50升每小时；其他参数的调整如图2所示。

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（四）测定样品及溶液的配置

1、样品处理

在对这21种磺胺类药品进行进行测定之前，应先对样品进行处理，首先，我们需要将测定样品各称取5克放置到容积为50毫升的离心管当中，并在离心管中放入15毫升的乙酸乙酯溶液，然后将其置于超声波清洗器中处理1分钟，取出后放入5克经过灼烧处理以后的无水硫酸钠并摇晃均匀，然后用超声提取10分钟，将其放入高速离心机中以每分钟7000转的速度处理5分钟，取出后把调制好的乙酸乙酯溶液进行合并，并放入旋转蒸发仪中进行减压浓缩，取出后掺入1毫升的甲醇与2毫升体积分数为1%的乙酸溶液对样品进行溶解，以此实现对样品的提取。样品提取后，将样品提取液放到到小柱当中，然后安装固相萃取装置、机械泵，并将SPE装置与HLB柱进行连接后对样品提取液进行萃取，需要注意的是，流速应不超过2毫升每分钟，然后采用2毫升体积分数为5%的甲醇溶液对小柱进行淋洗，再采用10毫升的甲醇试剂进行洗脱，此时，流速应不超过2毫升每分钟，然后对洗脱液进行收集，将其放入氮吹仪中用35℃的水浴氮气对洗脱液进行吹干。吹干后用1毫升流动相定容，并放入0.2微米的滤膜来对溶液进行过滤，以此实现对样品的净化，净化以后方能对样品进行液相色谱-串联质谱测定。

2、储备液、中间液及工作液的配置

在进行液相色谱-串联质谱测定之前，需要提前称取磺胺类药品各0.01克，然后用甲醇试剂对药品进行溶解，使其配置成为浓度为100毫克每升的储备液，并放入到冰箱中进行储存。中间液的配置需要利用甲醇试剂来配置为磺胺类药物浓度为10毫克每升的溶液。工作液的配置应分别进行稀释， 使其成为 1μg/L、2μg/L、4μg/L、8μg/L、10μg/L 的工作液，当要对工作液进行临时使用时，应将其配制添加到空白基质当中，并且每次测定应抽取10μL的工作液进行测定。

二、测定方法

本次测定通过在测定过程中掺入体积分数为0.1%的甲酸试剂，来实现对流动相PH值的调节，从而确保测定过程中的磺胺类药物组分能够进行分离，并通过在水相中掺入浓度为0.5mol/L的乙酸铵试剂，实现对各磺胺类药物组分的保留，并能对各组分峰形进行大幅度改善。依据所测定磺胺类药物21种组分的分子结构，测定电离方式设定为ESI+，并将这21种磺氨类药物的组分分别配制成1ng/mL的甲醇溶液，然后利用串联质谱仪来扫描离子峰值，并以此作为基础对其分别进行母离子二级质谱分析，以此明确质谱中信号最强的两种碎片离子，将子离子与母离子进行组合，使其成为离子对并进行监测，然后通过MRM来对样品定性及定量进行分析。为了使测定的灵敏度更高，本次测定将MRM程序设定为七个，以此实现对这21种磺胺类药物组分的出峰时间所产生的信号进行收集。本次实验所选取的试剂包括乙酸乙酯、二氯甲烷及乙腈，用来对海产品中的磺胺类药物进行分别提取，并对结果进行了对比。此外，本次试验对样品净化条件进行了选择，并对C18固相萃取小柱与HLB小柱进行了对比实验，最终确定由Qasis HLB来实现对样品的净化，并采取将磺氨标准溶液添加至空白基质的方式来对线性范围进行确定。本次试验将日本对虾、大菱鲆及三疣梭子蟹这三类海产品作为研究对象，对其回收率、检出限、线性范围及精密度进行研究，并在样品中分别添加了三种磺胺类混合标准溶液，回收率及精密度计算中均重复三次实验，检出限以3倍信噪比为准，定量限以10倍信噪比为准。

三、测定结果

通过对七个MRM程序中21种磺胺信号的出峰时间信号进行收集，并利用串联质谱仪来进行扫描，扫描谱图结果如图3所示。

图3 21种磺胺类药物信号出峰时间扫描谱图

依据出峰顺序来进行排列，从左至右依次为：磺胺、磺胺噻唑、磺胺二甲基异恶唑、磺胺硝苯、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺醋酰、磺胺氯哒嗪、甲氧芐氨嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲基嘧啶、磺胺苯吡唑、磺胺二甲异嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺吡啶、磺胺噻唑、磺胺胍、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧嗪哒。

经过测定结果表明，在乙酸乙酯、二氯甲烷及乙腈试剂分别对海产品中的21种磺胺类药物提取中，二氯甲烷的提取率最低，而乙酸乙酯与乙腈试剂的提取效率则相对较高。在利用Qasis HLB对样品进行净化时，净化效果效好，样品回收率高，且操作要求低，能够非常容易的进行重复操作。经过对线性范围的确定，并以磺胺混合标准溶液来将其添加到空白基质当中，使其成为标准区线，经过测定结果表明，当线性范围处于1至1004μg/L时，效果最好。对日本对虾、大菱鲆及三疣梭子蟹的线性范围、精密度、检出限及回收率进行测定时，测定结果表明，当标准溶液添加量至1至5μg/Kg时，日本对虾及大菱鲆样品中的21种磺胺药物平均回收率均在68%至82%，回收率标准偏差范围在4.1%至11.8%。以10倍信噪比作为定量限测定时，定量限均不超过1.0μg/Kg，以3倍信噪比作为检出限测定时，检出限均不超过0.5μg/Kg。这三种海产品的21种磺胺类药物残留测定结果如图4所示。

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四、讨论

通过对测定结果进行分析可知，由于磺胺类药物组分耐热能力较差，而乙腈试剂的沸点则相对较高，这就使磺胺类药物浓缩时增加很大难度，而在用乙酸乙脂进行浓缩时，回收率较好，并且SPE净化以后不会出现干扰问题，因此选择乙酸乙酯试剂最佳。在对样品净化时，由于磺胺类的PH值偏向于弱减性，而仅靠溶液的方式是很难去除掉样品中的干扰物质的，从理论上来讲，固相萃取小柱与HLB小柱都适用于对磺胺类药物的净化，不过，比较适用于非极性至中极性的磺胺类药物净化，而HLB小柱则本身有亲脂亲水性，因而不存在抽干问题，碳链也不会产生塌陷现象，因此，HLB小柱对样品的净化效果更好。从图3中我可以看出，这种测定方法的灵敏度很高，通过对质谱与色谱的调整，能够极大程度的提高21种磺胺类药物组分的响应值。此外，如果对噪音进行降低，并选取等级更高的试剂，液相色谱-串联质谱法的检出限将更加精确，也将更能满足对海产品磺胺类药物的残留检测要求，而这种超高效的测定方法，有效弥补了国内测定种类少，灵敏度不高的缺陷，因此极具应用价值。

结语

本次测定方法将日本对虾、大菱鲆及三疣梭子蟹这三类海产品作为测定样本，通过利用乙酸乙酯试剂来对21种磺胺类药物组分进行提取，并用HLB小柱其进行净化，以小柱作为色谱柱，通过采用乙酸铵溶液及甲醇试液作为流动相，利用液相色谱-串联质谱仪来对这三种海产品中的21项磺胺类药物组分残留进行同时检测，并依据质谱数据及时间的差异性来对其进行定性与定量分析，从而取得良好的检测效果。该测定方法与气-质联用法、高效液相色谱法、免疫测定法的优势相比较，气-质联用法具备极强的分离能力，但对未知化合物的定性能力不足。而液相色谱-串联质谱法则充分结合了气-质联用法的分离优势，并且弥补了对未知化合物定性能力不足的缺陷。高效液相色谱法具备反复使用、易回收及样品不被破坏等优点，但它的缺点也非常明显，就是柱外效应，分离物质的扩散与滞留现象都会使高效液相色谱法的灵敏度受到影响，而液相色谱-串联质谱法则具备易回收、样品不被破坏的优势，虽然灵敏度会受到流动相试剂等级与噪音的影响，但不会受到分离物质扩散与滞留现象的影响。免疫测定法具备操作简便、特异性强的优势，但缺点是其应用范围十分有限。而该测定方法的重现性较好，线性范围非常宽，因此更适合对海产品磺胺类药物进行测定。更重要的是，以上三种方法都只能对其中几种磺胺类药物残留进行测定，而液相色谱-串联质谱法则能同时对上述21种磺胺类药物残留进行同时测定，因此其应用前景十分广阔。

[1]孙玉增、徐英江、刘慧慧、张世娟、秦华伟、高继庆.液相色谱-串联质谱法测定海产品中21种磺胺类药物残留[J].食品科学,2010,31(02):120-123.[2017-08-05].

[2]吴海燕、郭萌萌、谭志军、李兆新、翟毓秀.磺胺类药物残留稳定性研究及检测方法的比较 [J].中国农学通报,2014,30(05):53-60.[2017-08-05].

[3]赵书景、贺绍君、罗国琦、袁逢新、张卫宪.动物性食品中磺胺类药物残留检测方法的研究进展[J].中国畜牧兽医,2009,36(08):60-63.[2017-08-05].

[4]刘丽、孙春云、郑志伟、黄广欣.海产及其干制品中重金属和农兽药残留状况概述[J].中国卫生检验杂志,2009,19(11):2722-2724.[2017-08-05].

[5]王伟华、韩占江、魏新军、张浩、陈洺阳、吴峥.酶联免疫吸附法在磺胺类药物残留检测中的应用[J].安徽农业科学 ,2006,(06):1101+1106.[2017-08-05].DOI：10.13989/j.cnki.0517-6611.2006.06.031.