一种谷氨酸棒杆菌基因无痕敲除载体的构建及应用

王 蕾，汪俊卿，薛 乐，李丕武，王腾飞，苏 静，王瑞明*

（齐鲁工业大学（山东省科学院）生物工程学院，山东 济南 250353）

谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）是从土壤中分离到的一种无病原性的兼性厌氧的革兰氏阳性菌。谷氨酸棒杆菌呈棒杆状，单个或两个呈“V”字形排列[1-2]。KINOSHITA S等[3]研究发现谷氨酸棒杆菌可以高产谷氨酸，这使得谷氨酸棒杆菌具有重要的经济价值。随着对谷氨酸棒杆菌的进一步研究，发现其作为食品安全级的微生物可以被应用于多种氨基酸的发酵生产，包括赖氨酸、L-异亮氨酸和L-甲硫氨酸[4-8]。

目前利用谷氨酸棒杆菌来生产某种特定氨基酸时，最后发酵液中总是会产生很多的副产物氨基酸，导致碳流量的浪费。为了避免这种现象的发生，通常利用基因敲除手段和代谢工程手段来改良谷氨酸棒杆菌以达到某种氨基酸高产的目的[9-11]。目前，通过同源单交换原理在谷氨酸棒杆菌中运用的敲除载体有许多种，这些载体大多通过扩增待敲除基因的上下游同源臂并将其连接到pK18mobsacB、pK19mobsacB等穿梭质粒上构成的。而这些载体大多都是通过果聚糖蔗糖酶编码基因sacB来实现二次筛选的[12]，如徐建中[13]构建了含有待敲除基因上下游同源臂基因、卡那霉素抗性基因、sacB反向筛选标记基因的一种新型非复制型质粒pK18mobsacB-ΔA：：B，将其电转到谷氨酸棒杆菌细胞中，成功实现pck、ala T和avt A基因的敲除，但是运用蔗糖来实现二次筛选存在许多弊端，比如经过几次传代后谷氨酸棒杆菌会对蔗糖产生抗性甚至会导致基因突变等。这些弊端都会给最终筛选阳性克隆子带来困难。研究发现，大肠杆菌毒素蛋白基因mazF作为反向筛选标记基因，具有二次筛选效果好，阳性率高等优势[14]，而选择具有特别严谨的转录调控系统的木糖启动子基因Pxyl来控制MazF的表达更加提高了阳性重组子的筛选率[15]。

本研究首先分别获取目的基因的上下游同源臂，利用重叠聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）将其融合为一个长片段，并构建了由木糖启动子基因Pxyl和毒素蛋白基因mazF组成的筛选盒，利用无缝克隆的原理将这两段基因插入到带有卡那霉素抗性基因的pTOPO载体中，构建成一个能在谷氨酸棒杆菌中通用的敲除载体。将其转化到谷氨酸棒杆菌中，通过两次同源单交换原理[16]，实现了谷氨酸棒杆菌中的lysP基因的敲除。本研究构建了一种高效的、通用的谷氨酸棒杆菌基因敲除载体，以期为其他微生物的基因敲除提供了借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株、质粒与引物

菌株谷氨酸棒杆菌（Corynebacteriumglutamicum）CICC 23604：中国工业微生物菌种保藏管理中心；大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α（作为克隆宿主）：艾德莱生物科技有限公司；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）168：杭州宝赛生物科技有限公司；将卡那霉素抗性基因连接至pTOPOBlunt载体的多克隆位点处得到质粒pTOPO-kan，此质粒为本实验室保藏。实验所涉及引物见表1所示。

表1 本研究所用引物及序列Table 1 Primers and sequences used in the study

1.1.2 培养基

种子培养基采用LBG培养基：葡萄糖0.5%，蛋白胨1%，酵母浸粉0.5%，氯化钠1%，pH7.0～7.4。

发酵培养基：葡萄糖2%，玉米浆3%，硫酸铵2%，醋酸钠1%，尿素0.5%，L-丙氨酸0.134%，磷酸二氢钾0.2%，结晶硫酸镁0.135%，七水硫酸亚铁0.002%，结晶硫酸锰0.004%，烟酰胺0.000 8%，生物素0.000 1%，亮氨酸0.034%。

电转缓冲液：甘油10%。

菌体复苏培养基：酵母浸粉0.25%，蛋白胨0.5%，氯化钠0.5%，脑心浸出液1.85%，山梨醇9.1%。

以上培养基均需在高压蒸汽灭菌锅中115℃灭菌20 min，葡萄糖单独灭菌。

1.1.3 试剂

限制性内切酶：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒、SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒、柱式DNA产物纯化试剂盒、DNA Marker：生工生物工程（上海）股份有限公司；高纯度质粒小量快速提取试剂盒：艾德来生物技术有限公司；酵母浸粉、蛋白胨（均为生化试剂）：北京奥博星生物技术有限公司；ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit重组克隆试剂盒：南京诺唯赞生物科技有限公司；Alkaline Phosphatase（Calf intestine）试剂盒：山东赛恩斯科技有限公司。

1.2 仪器与设备

ZQZY-CS恒温振荡培养箱：上海知楚仪器有限公司；ThermoblockPCR仪：德国Veriti公司；DYY-12型电泳仪：北京市六一仪器厂；MD2000H核酸超微量系列分光光度计：英国BioFuture公司；5804R型离心机、4308型电转仪：德国Eppendorf公司；7200可见分光光度计：尤尼柯上海仪器有限公司；SBA-40D生物传感分析仪：山东省科学院生物研究所；Hitachi日立紫外分光光度计、L-8900型高速氨基酸自动分析仪：日本日立公司。

1.3 实验方法

1.3.1 重组同源性片段lysPF-lysPR的制备

使用上海生工Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒提取C.glutamicum23604菌体的DNA，并以此为模板，使用引物LysPF F1和LysPF R1进行PCR扩增lysPF片段，使用引物LysPRF2和LysPRR2进行PCR扩增lysPR片段，扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，lysPF（58℃）、lysPR（58℃）退火30 s，72℃延伸1.5 min，30个循环；72℃延伸10 min，4℃保存，使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒（上海生工）制得的lysPF片段与lysPR片段为模板，LysPFF1和LysPRR2为引物进行重叠延伸PCR[17]，PCR扩增条件为：（1）95 ℃预变性5 min；95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，5个循环；72℃延伸10 min；（2）95℃预变性5 min，95℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸2.5 min，30个循环；72℃延伸10 min，4℃保存，扩增制得同源重组片段lysPF-lysPR，使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒（上海生工）进行胶回收，于-20℃保存备用。

1.3.2 筛选标记基因Pxyl-mazF-ter的制备

分别提取大肠杆菌DH5α和B.subtilis168的基因组DNA，以前一个基因组作为模板，使用MazF F3和MazF R3扩增mazF片段；以后一个基因组作为模板，使用PxylF4和PxylR4、Ter F5和Ter R5分别进行PCR扩增Pxyl片段和ter片段，扩增条件为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，mazF（53℃）、Pxyl（53℃）、ter（62℃）退火30 s，72℃延伸2 min，30个循环；72℃延伸10 min，4℃保存，分别扩增获得mazF片段、Pxyl片段和ter片段。首先将mazF片段和ter片段利用重叠PCR原理融合为一个片段。扩增条件为：（1）95℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，5个循环；72℃延伸10 min；（2）95℃预变性5 min；94℃变性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒（上海生工）进行胶回收得到mazF-ter。将Pxyl片段和mazF-ter片段采用重叠PCR的方法制得融合片段，扩增条件为：（1）95℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，5个循环；72℃延伸10 min；（2）95℃预变性5 min；94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸2.5 min，30个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。上述PCR过后使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒（上海生工）进行胶回收得到Pxyl-mazF-ter片段，于-20℃保存备用。

1.3.3 整合型质粒pTOPO-Pxyl-mazF-lysP的构建

对质粒pTOPO-kan用限制性内切酶Hind III进行单酶切线性化，用无缝克隆试剂盒将线性化克隆载体与插入片段lysPF-lysPR于冰水浴中配制实验组和对照组的反应体系：线性化克隆载体、插入片段分别添加0.9μL（质量浓度为73 ng/μL）和1.2 μL（质量浓度为37 ng/μL），在实验组加入4 μL 5×CE Multis Buffer和2 μL Exnase Multis，补加ddH2O至20 μL；对照组直接补加ddH2O至20 μL。（其中线性化克隆载体和插入片段的添加量按照试剂盒说明测完浓度之后计算添加量）。使用移液枪上下轻轻吹打混匀，于37℃反应30min。待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5 min。取10 μL冷却反应液加入100 μL DH5α感受态细胞中，置于冰上30 min，之后于42℃水浴热击90 s，冰上放置5 min，加入1 mL LB培养基，37℃、200 r/min培养1 h。将转化产物涂布于含有卡那霉素抗性的LB平板上，于37℃恒温培养箱培养过夜，筛选阳性克隆子，用LysPF F1和LysPR R2作为引物进行菌落PCR验证。将构建好的质粒pTOPO-kanr-lysPF-lysPR用Hind III进行单酶切线性化，利用无缝克隆相同的方法将Pxyl-mazF-ter片段与线性化载体连接，反应体系除了线性化克隆载体、插入片段分别添加0.7 μL和5.7μL外，其他都与上述一致，最终构建成pTOPO-Pxyl-mazF-lysP重组表达载体，转化到DH5α感受态细胞中，并筛选阳性重组子，用引物PxylF4和Ter R5来进行菌落PCR鉴定。整个构建过程如图1所示。

图1 C.glutamicum23604ΔlysP构建流程图Fig.1 Flowchart of construction ofC.glutamicum23604Δlys

1.3.4 重组质粒pTOPO-Pxyl-mazF-lysP的转化

提取pTOPO-Pxyl-mazF-lysP质粒，用乙醇沉淀法浓缩质粒到质量浓度为1 μg/μL，参考RUAN Y等[18]发明的谷氨酸棒杆菌的电转方法将其转至C.glutamicum23604感受态细胞，涂布于含卡那霉素的LBG平板上（卡那霉素质量浓度为25 μg/mL），30 ℃条件下倒置培养24～48 h，筛选阳性转化子。

1.3.5 阳性重组子的筛选与鉴定

挑取卡那霉素抗性平板上生长出的单菌落接种于液体LBG培养基中培养起来，提取其基因组作为模板DNA，用LysPF F1和LysPR R2作为引物进行PCR验证。验证正确的菌即为发生了第一次同源单交换的重组菌。将验证正确的重组菌接种到不含抗生素的LBG液体中培养，自然传代3次，每代培养24 h，最后取200 μL菌液涂布到含有5%木糖的LBG固体培养基（不含抗生素）上，让其生长18～24 h，挑取平板上长出的单菌落并接种到液体培养基中，提取基因组，用LysPF F1和LysPR R2作为引物进行PCR验证，筛选发生两次同源单交换的重组菌。

1.3.6 重组菌发酵液中赖氨酸和发酵结束后各种氨基酸含量的测定

取活化后的种子培养液转接于装液量为100 mL发酵培养基的500 mL三角瓶中，接种量为5%、30℃、200 r/min培养，每隔4h取样2mL，将发酵液稀释一定倍数，蒸馏水为对照，测定OD600nm。将发酵液10 000 r/min离心10 min除去菌体，取上清液，用SBA生物传感分析仪测定对照菌和重组菌发酵液中的葡萄糖含量，赖氨酸含量。并结合氨基酸自动分析仪来检测发酵结束后各种氨基酸的含量。

2 结果与分析

2.1 目的基因的获取

以C.glutamicum23604菌株基因组DNA为模板，以不同的引物分别PCR扩增得到大小分别约为536 bp用于lysP基因敲除的上游同源臂lysPF（图2a）和大小约为592 bp的下游同源臂基因片段lysPR（图2b），然后通过重叠PCR的方法将两个同源臂融合成长度为1 128 bp的lysPF-lysPR片段（图2c）；以B.subtilis168菌株的基因组DNA为模板，PCR扩增得到大小约为1 532 bp的木糖启动子Pxyl基因（图2d）和大小约为303 bp终止子基因ter（图2e）；以大肠杆菌基因组DNA为模板，PCR扩增大小约为336 bp的mazF片段（图2f），利用重叠PCR先将mazF片段与ter融合得到大小约为639 bp的mazF-ter片段（图2g），同样通过重叠PCR的方法将Pxyl片段和mazF-ter片段融合成长度约为2 171 bp的Pxyl-mazF-ter片段（图2h）。上述PCR产物电泳结果均显示扩增出与目的基因大小相符的DNA片段。

图2 PCR扩增产物电泳图Fig.2 Electrophoresis of amplified products of PCR

2.2 整合型质粒pTOPO-Pxyl-mazF-lysP的构建与鉴定

对质粒pTOPO-kan用Hind III进行单酶切线性化，然后进行去磷酸化，用无缝克隆试剂盒将线性化克隆载体与插入片段lysPF-lysPR于冰水浴中配制实验组和对照组的反应体系，参照1.2.3中介绍的方法将反应体系转化到DH5α中，菌落PCR筛选阳性克隆子，结果见图3a。由图3a可知，泳道5对应的条带大小约为1128bp，与目的条带大小相符，选择5号泳道对应的菌送去上海生工测序，比对序列之后结果都正确。说明lysPF-lysPR片段成功连接到pTOPO-kan质粒上。将Pxyl-mazF-ter片段与线性化载体连接并转化到DH5α中，菌落PCR验证正确性，结果见图3b。由图3b可知，2、4、5泳道出现的条带是没有目的基因连入载体产生的非特异性扩增。6号泳道中的条带大小约为2 171 bp与目的条带相符。将其所对应的菌送去上海生工测序，序列比对结果正确，说明目的条带Pxyl-mazF-ter成功连接到pTOPO-kan-lysPF-lysP质粒上。最终整合型质粒pTOPO-Pxyl-mazF-lysP构建完成。

图3 菌落PCR验证目的基因电泳图Fig.3 Electrophoresis of amplified products of colony PCR toverify target gene

2.3 整合型质粒pTOPO-Pxyl-mazF-lysP的转化与鉴定

图4 菌落PCR验证目的基因电泳图Fig.4 Electrophoresis of amplified products of colony PCR to verify target gene

提取质粒pTOPO-Pxyl-mazF-lysP，用乙醇沉淀法浓缩之后测得质粒浓度为1 μg/μL，电转至C.glutamicum23604感受态细胞中，将卡那霉素抗性平板上长出的单菌落提取基因组，用LysPF F1和LysPR R2为引物进行PCR验证，结果见图4a。由图4a可知，1、2泳道中都出现了两条条带，长度大约为1 377 bp和1 128 bp，说明质粒已经成功地整合到了C.glutamicum23604的基因组中，使得菌落PCR结果中出现了一条长度为1 377 bp的完整的lysP基因条带和一条长度为1 128bp的lysPF-lysPR基因条带。将验证正确的重组菌连续自然传代3次后，取200 μL的菌液涂布在含有5%木糖的LBG固体培养基上进行筛选培养18～24 h，对平板上长出的单菌落提取基因组，以LysPF F1和LysPR R2为引物进行PCR鉴定，结果见图4b。由图4b可知，1～6号泳道可以看出有3种类型的条带：1、6号泳道在1 128 bp左右出现条带，说明对应的谷氨酸棒杆菌中lysP基因经过两次单交换成功被敲除；3号泳道在1377bp左右出现条带，说明对应的谷氨酸棒杆菌的lysP基因完整，没有发生单交换；2、4、5号泳道出现两条条带，说明对应的谷氨酸棒杆菌只完成了一次单交换，没有出现双交换的菌株，因为发生双交换的菌株不会在卡那霉素抗性平板上生长。

2.4 C.glutamicum23604、C.glutamicum23604ΔlysP的生长曲线和葡萄糖的消耗情况

蒸馏水为对照，测定发酵液的OD600nm，结果如图5a所示。将发酵液10 000 r/min离心10 min除去菌体，取上清液，用SBA生物传感分析仪测定发酵液中的葡萄糖含量，结果如图5b所示。由图5a可知，C.glutamicum23604与C.glutamicum23604ΔlysP的生长情况相近，表明lysP基因敲除对C.glutamicum23604ΔlysP在以葡萄糖为碳源培养基上的生长没有显著影响。由图5b可知，对照菌和重组菌对葡萄糖的利用情况大致相同，表明lysP基因缺失后并不影响其对葡萄糖的利用。

图5 C.glutamicum23604和C.glutamicum23604ΔlysP生长曲线（a）和葡萄糖的消耗量曲线（b）Fig.5 Growth and glucose consumption curves ofC.glutamicum 23604 andC.glutamicum23604ΔlysP

2.5 重组菌发酵液中的赖氨酸含量的测定

用SBA生物传感分析仪测定C.glutamicum23604与C.glutamicum23604ΔlysP发酵液中的赖氨酸含量，结果见图6。由图6可知，对照菌和重组菌的赖氨酸的产量趋势都是递增的，但是重组菌的赖氨酸产量在后期要比对照菌的产量高，发酵结束后重组菌赖氨酸的产量比对照菌增加了10%。说明控制赖氨酸胞内转运的酶失活，使得发酵液中的赖氨酸不能进入胞内，从而在胞外积累。

图6 C.glutamicum23604与重组菌发酵产赖氨酸曲线Fig.6 Fermentation curves of lysine byC.glutamicum23604 and C.glutamicum23604ΔlysP

2.6 发酵结束后其他氨基酸含量的测定

取发酵结束后的菌液离心去菌体后，将其稀释合适的倍数，测定C.glutamicum23604与C.glutamicum23604ΔlysP发酵结束后氨基酸的含量变化。结果见表2。由表2可知，对照菌赖氨酸的产量为3.42 g/L，重组菌为3.79 g/L，提高了10.8%。其他的氨基酸的种类相同且含量差别甚小。因此说明敲除lysP之后不会影响C.glutamicum23604ΔlysP产其他的氨基酸，只影响赖氨酸的产量，表明LysP是一种特异性较强的氨基酸转运蛋白。

表2 氨基酸的含量测定结果Table 2 Determination results of amino acid contents

3 结论

目前，对谷氨酸棒杆菌进行基因敲除时，大多选用的都是含有果聚糖蔗糖酶编码基因sacB的敲除载体，而菌体在后续传代筛选的自发突变影响了后续阳性克隆的筛选效率。本实验针对现有技术的不足，构建了一种高效筛选阳性重组菌的敲除载体。首先利用重叠PCR扩增技术将待敲除的目的基因的上下游同源臂基因融合成一个片段；选择大肠杆菌毒素蛋白基因mazF为反向筛选基因，选择B.subtilis168中的木糖启动子来启动毒素蛋白基因表达从而构建成毒素蛋白筛选盒。通过两次无缝克隆的方法，将这两段插入到带有卡那霉素抗性的pTOPO载体上构建成了能在谷氨酸棒杆菌中通用的基因敲除载体。在此基础上，如果想要完成谷氨酸棒杆菌中其他基因的敲除，只需扩增出待敲除基因的上下游同源臂融合基因，利用无缝克隆方法替换lysP基因即可，大大提高了敲除效率。

本研究成功构建了lysP基因缺失菌株C.glutamicum 23604ΔlysP，获得的lysP基因缺失菌株C.glutamicum23604 ΔlysP经过初步发酵研究，发现重组菌株的赖氨酸产量明显比原始菌提高了10.8%，表明C.glutamicum23604中的lysP基因已被成功敲除，在后续实验中需要进一步优化重组菌株的发酵条件，进一步提高赖氨酸产量。

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