解淀粉芽孢杆菌HAB-6抑菌物质及其相关基因的分析

王皓楠， 靳鹏飞， 康 迅， 谢清标， 刘文波， 郑服丛， 缪卫国

(海南大学环境与植物保护学院，海南海口 570228)

芽孢杆菌在生长过程中能够产生不同的抑菌物质，已报道的脂肽类物质是芽孢杆菌作为生防菌产生的最主要的抑菌物质，尤其是其可以产生具有极高生物工程利用价值的脂肽类和肽类抗生素[1-2]，如非核糖体途径合成的脂肽类抗生素表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素(iturin)和丰源素(fengycin)；核糖体途径合成的肽类抗生素枯草菌素(subtilin)和类羊毛硫抗生素(lantibiotic-like peptides)[3-4]等。脂肽类物质在植物病害生物防治过程中发挥着重要的作用[5-12]，其结构一般是由1个β-羟基脂肪酸与7～10个氨基酸以酰胺键形式连接的环肽[13]。Iturin家族的脂肽类化合物由七肽与14～17个碳原子的β-氨基脂肪酸链相连而成，包括7个异构体iturin A、iturin C、杆菌抗霉素(bacillomycin)D、bacillomycin F、bacillomycin L、bacillomycin LC和抗霉枯草菌素(mycosubtili)。在体外检测中，iturin表现出广谱的抗真菌活性和微弱的抑细菌活性，主要抑制真菌生长[14-18]。Surfactin家族脂肽类化合物是七肽与β-羟基脂肪酸交联形成的内酯环状结构，细分为surfactin A、surfactin B、surfactin C1、surfactin C2等，主要抑制细菌、病毒、支原体生长[18-19]。Fengycin是由十肽与β-氨基脂肪酸链(C14～C18)形成的内酯环，包括fengycinA和fengycinB这2类——对丝状真菌有强烈的抑制作用。另有研究表明，surfactin与iturin、surfactin与fengycin、iturin与fengycin两两之间存在协同效应，能够有效地增强后者的抑菌活性[18，20-21]。

芽孢杆菌脂肽类抗生素合成基因的特点是抗生素合成受一个大的基因簇控制，基因簇由合成基因、调控基因共同组成[22]。脂肽类抗生素是通过非核糖体途径合成的，其合成酶须要翻译后经修饰才有活性，该过程由共价调节酶磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(phosphopantetheinyl transferase，PPTases)催化[23]。Surfactin由surfactin合成酶，即非核糖体多肽合成酶(nonribosomalpeptide synthetases，NRPS)催化得到，在sfp基因缺失的情况下将不能产生surfactin，将外源基因整合入枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)168菌株中，使其产surfactin[24]。在枯草芽孢杆菌168中由于没有编码PPTases的基因，尽管其含有surfactin和fengycin等2种脂肽类抗生素合成酶基因，却不产生任何脂肽类抗生素[23]。芽孢杆菌脂肽的快速检测一般采用分析化学的方法，如高效液相质谱、核磁共振等方法。目前，用分子生物学来检测芽孢杆菌脂肽类物质越来越普遍，根据芽孢杆菌脂肽的生物合成相关基因(sfp、srf、fenD、ituC、bmyB等)设计引物，从而快速检测抗菌脂肽。

前期研究发现，笔者所在实验室获得的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)HAB-6菌株具有广谱抑菌活性，本研究对HAB-6菌株产脂肽类物质的机制进行初步探究，表明其基因组中含有脂肽类物质的合成基因和调控基因，可以为今后研究HAB-6菌株中脂肽类物质的功能提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 菌株

解淀粉芽孢杆菌HAB-6菌株由笔者所在实验室从豇豆中分离得到；芒果炭疽病菌(ColletotrichumgloeosporioidesPenz)为笔者所在实验室保存，作为HAB-6菌株抑菌活性测定的主要靶标菌；感受态细胞为笔者所在实验室保存的大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α。

1.2 培养基

LB液体培养基：胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g，NaCl 10 g、5 mol/L NaOH调节pH值至7，用去离子水定容至 1 L；马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、去离子水定容至1 L。

1.3 HAB-6菌株脂肽类合成基因PCR检测

HAB-6菌株接种于LB培养基中，在28 ℃、180 r/min条件下培养48 h。提取HAB-6菌株总DNA，以总DNA为模板，分别用10对ituC、srfAB、sboA、ituD、qk、fenD、bamC、yndj、ituB、fenB脂肽类抗生素合成相关基因引物[25](表1)，进行靶标基因的PCR扩增。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 60 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s，30个循环；72 ℃ 10 min。PCR扩增产物经电泳胶回收后进行TA克隆，转化后送华大基因公司测序，测序结果经Blast比对分析。

表1 HAB-6菌株扩增基因及引物序列

1.4 脂肽类关键合成酶基因PCR扩增

以HAB-6菌株总DNA为模板，分别用6对脂肽类关键合成酶基因ituA、ituD、lpa-14、sfp、mycB、fenB的引物进行靶标基因的PCR扩增。PCR扩增产物经电泳胶回收后进行TA克隆、转化后送华大基因测序，结果经NCBI数据库Blast比对分析。

表2 扩增基因及引物序列

1.5 酸沉淀法提取脂肽类物质

HAB-6菌株发酵液于10 000 r/min离心10 min，去除菌体得离心上清液，6 mol/L的HCl溶液调pH值至2.0，4 ℃静置过夜，离心收集沉淀，用甲醇溶液溶解沉淀，为脂肽类物质粗提物[9]。用滤纸片法检测脂肽类物质的抑菌活性。

1.6 LC-MS色谱条件

色谱柱SMB200-12C18柱(4.6 mm×250 mm，12)；流动相为0.05%甲酸水溶液(A) ∶乙腈(B)，梯度洗脱(表1)；流速为 1 mL/min；柱温30 ℃；检测波长235 nm；进样量20 mL[22]。

表3 分析色谱梯度洗脱程序

1.7 脂肽类物质粗提物抑菌活性检测

将芒果炭疽病菌接种于9.0 cm PDA培养平板中央，在距离中央2.5 cm的位置等距离接种HAB-6菌体和滤纸片，每片滤纸片上加15 μL HAB-6菌株发酵上清液和脂肽类粗提物，将培养皿倒置于28 ℃培养箱中培养5 d，观察。

2 结果与分析

2.1 脂肽类基因序列检测

用10对引物扩增，HAB-6菌株中分5个基因片段ituC、srfAB、ituD、fenD、yndj与目标片段长度一致(图1)。对扩增得到的5个基因片段进行测序，经NCBI的Blast比对分析，分别为ituC、srfAB、ituD、fenD、yndj，条带大小与目标条带大小一致。其中HAB-6菌株中的ituC基因序列与B.subtilisB010菌株的ituC基因(GU062715.1)同源性达到97%，HAB-6菌株中的srfAB基因序列与B.amyloliquefaciens菌株的srfAB基因(AJ575642.1)同源性达到96%，HAB-6菌株中的ituD基因序列与B.amyloliquefaciensQ-426菌株的ituD基因(JQ271536.1)同源性达到98%，HAB-6菌株中的fenD基因序列与B.amyloliquefaciensSQR9菌株的fenD基因(CP006890.1)同源性达到98%，HAB-6菌株中的yndj基因序列与B.amyloliquefaciensSQR9菌株的yndj基因(JN093032.1)同源性达到97%。

2.2 脂肽类合成酶基因序列检测

用10对引物扩增，HAB-6菌株中得到5个基因片段ituA、lpa-14、sfp、mycB、fenB与目标片段长度一致(图2)。对扩增得到的5个基因片段进行测序，经NCBI的Blast比对分析，HAB-6 菌株中的ituA基因序列与B.amyloliquefaciens菌株的ituA基因(KF765804.1)同源性达到98%；HAB-6菌株中的lpa-14基因序列与B.subtilisRP24菌株的lpa-14基因(EU797520.1)同源性达到98%；HAB-6菌株中的sfp基因序列与B.amyloliquefaciensS20菌株sfp基因(JX414225.1)同源性达到99%；HAB-6菌株中的mycB基因序列与B.amyloliquefaciensQ-426菌株的mycB基因(JQ271536.1)同源性达到96%；HAB-6菌株中的fenB基因序列与B.amyloliquefaciensS20菌株的fenB基因(JX414225.1)同源性达到96%。

2.3 HAB-6菌株脂肽类抗生素组成

通过HAB-6菌株脂肽类物质粗提物的液质联用可以发现，保留时间在3.31、7.70、24.67、25.35 min对应的相对分子质量分别为1 041.5、1 083.6、1 006.6、1 034.7(图3)，与脂肽类物质相对分子质量吻合(表4)。质荷比(m/z) 1 042.5、1 084.6、1 007.6、1 035.7所对应的脂肽类抗生素为C14Iturin A、C17Iturin A、C13Surfactin A、C15Surfactin C[26]。

2.4 脂肽类物质活性检测

通过对峙培养，显示HAB-6菌株及其发酵上清液均对芒果炭疽病菌有明显的抑制作用，产生明显的抑菌带，但将HAB-6菌株发酵离心上清液通过酸沉淀法提取的脂肽类物质对芒果炭疽病菌没有抑菌活性，说明脂肽类物质不是 HAB-6 菌株的抑菌活性物质(图4)。

3 结论与讨论

芽孢杆菌在自然生长和发酵培养后期产生的脂肽类物质是其最重要的抗菌物质[26]。Iturin只限于枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌中产生，抑制植物病原菌。Iturin家族通过与细胞膜相互作用引起孔隙形成，普遍对多种真菌有较强的抗真菌活性[27]。于是根据已知脂肽类物质的基因序列设计引物进行PCR，与已知基因经Blast比对，显示HAB-6菌株有合成脂肽类物质的5条基因。进一步设计引物对合成脂肽类物质关键酶基因进行扩增，HAB-6菌株含有编码关键酶的5条基因。Sfp基因编码的4′-磷酸泛酰巯基乙胺腺苷酰转移酶是芽孢杆菌非核糖体途径脂肽类物质合成的关键基因。SrfAB编码surfactin合成酶，surfactin合成酶通过磷酸泛巯基转移酶将4′-磷酸泛酰巯基乙胺腺苷酰转移酶以硫酯键连接到PCP结构域上[26-30]，活化后启动surfactin的合成[23]。在B.subtilis168中由于没有编码PPTases的基因，即sfp，尽管其含有surfactin和fengycin这2种脂肽类抗生素合成酶基因，却不产生任何脂肽类抗生素[26，31]。笔者所在实验室另一株解淀粉芽孢杆菌HAB-2菌株缺失sfp基因，但有lpa-14基因，同样能产生有抑菌活性的脂肽类物质。HAB-6菌株含有编码4′-磷酸泛酰巯基乙胺腺苷酰转移酶的sfp基因、lpa-14基因以及编码surfactin合成酶的srfAB基因，从基因的角度初步推测 HAB-6 菌株产生的脂肽类物质应具有抑菌活性。

通过LC-MS可以看出，HAB-6菌株代谢产生了 C14Iturin A、 C17Iturin A、 C13Surfactin A、C15Surfactin C等脂肽类物质。Iturin类家族的脂肽类化合物在抑制真菌病害中起着重要作用[9-10]。最近，Tanaka等研究表明，Iturin类化合物抗真菌活性随侧链长度增加：C17>C16>C15[28]。很多研究显示脂肽类物质具有相互协同作用[29]。对峙培养结果显示，HAB-6菌株以及其发酵液有抑制芒果炭疽病菌的活性，但是从HAB-6菌株发酵液中提取的脂肽类化合物没有抑制真菌的活性。说明提取的脂肽类物质不是HAB-6菌株抑制真菌的主要物质。Surfactin家族主要抑制细菌、病毒，对真菌没有明显的抑制作用，可能HAB-6菌株代谢产生的脂肽类物质中以surfactin为主。因此，HAB-6菌株脂肽类物质代谢途径以及抑菌活性物质的分离纯化还有待进一步研究。

表4 HPLC-ESI-MS脂肽类物质活性检测分析

解淀粉芽孢杆菌HAB-6具有脂肽类物质的合成基因yndj、srfAB、ituD、fenD、ituC和调控基因fenB、lpa-14、sfp、mycB、ituA，代谢产生C14Iturin A、C17Iturin A、C13Surfactin A、C15Surfactin C，但是酸沉淀提取得到的脂肽类物质不是 HAB-6 菌株抑制真菌的主要物质。

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