基于Fem AB基因特异引物的动物双歧杆菌PCR检测方法的建立

温学鹏，祁昊，郭思圻，王哲，高学军

（东北农业大学黑龙江省高校农业生物功能基因重点实验室，哈尔滨150030）

0　引 言

双歧杆菌属细菌是人与动物机体内常见的细菌之一，对改善机体内的菌群平衡、免疫能力等方面具有重要的价值[1]。

分子生物学的PCR鉴定技术如今广泛的应用于微生物的分类与鉴别，亦可用于双歧杆菌的鉴定[2]。双歧杆菌属内各个种中，常用于PCR鉴定的保守基因的相似度均很高，少数种相似度极高[3]，难以设计鉴定用特异引物，所以，寻找保守度较低一些的基因序列来设计特异引物是一个不错的解决方法，例如SodA基因可用于好氧细菌的PCR鉴定的特异引物设计之中[4]。

本实验分离了两株双歧杆菌，并以动物双歧杆菌中编码肽聚糖肽桥形成蛋白（Peptidoglycan bridge form ation protein）的Fem AB基因设计了特异引物行了鉴定实验，为Fem AB基因用于PCR菌种鉴定的可行性以及动物双歧杆菌的鉴定供了数据参考。

1　实 验

1.1　材料

（1）实验菌株。实验所用双歧杆菌菌株、屎肠球菌、枯草芽孢杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌菌株分离自某些益生菌药品制剂；两歧双歧杆菌、短双歧杆菌和青春双歧杆菌菌株，由东北农业大学乳品科学教育部重点实验室保藏。

（2）培养基。M RS培养基：蛋白胨10.0 g、牛肉粉5.0 g、酵母粉4.0 g、葡萄糖20.0 g、吐温80 1.0 mL、磷酸氢二钾2.0 g、醋酸钠5.0 g、柠檬酸氢二铵2.0 g、硫酸镁0.2 g、硫酸锰0.05 g，加蒸馏水配至1 L。固态培养基加2.0%琼脂。

（3）仪器与试剂。PCR反应仪（T-Gradient 96 Therm oblock Modul，Biometra），凝胶成像系统等，DN A提取试剂盒，琼脂糖凝胶DNA，回收试剂盒等。

1.2　方法

1.2.1菌种的分离纯化

采用平板划线法对菌株进行分离。培养温度采用37℃，培养时间为2-3 d。挑取单个菌落进行革兰氏染色并于镜下观察，依据《伯杰氏细菌鉴定手册》进行初步鉴别。反复若干次划线分离后取得单一形态菌落接至液态培养基，培养基变浑浊后取样，革兰氏染色，镜检，并于-80℃冻存。

1.2.2PCR模版的制备

将纯化后菌接种于M RS液体培养基，37℃培养。待菌液浑浊度适合时，离心沉淀菌体并用缓冲液离心洗涤菌体2次后，使用试剂盒提取其基因组DN A。提取方法按照回收试剂盒说明书进行。所有实验用菌株的DN A模板提取方法均一致。

1.2.3菌种的鉴定

（1）两株双歧杆菌的16S rDNA通用引物鉴定[5]。使用通用引物27F1492R（F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，R：GGTTACCTTGTTACGACTT）进行属分类水平的PCR分析鉴定。

（2）两株双歧杆菌的非特异随机引物鉴定。在NCBI数据库中查询相关信息，根据双歧杆菌属内菌种的全基因组序列情况进行分析，设计一对随机扩增引 物（XF：CTGTCGACTATGTGGGTGTCA，XR：CCTCGGTGATGCGGATGTTC），并进行PCR扩增及片段回收测序。

PCR体系：25μL体系，DMSO 2.5μL，10×Easy-Taq Bu ffer 2.5μL，dN TP M ixture 2.0μL，模板DN A 1.0μL，引物F为1μL，引物R为1μL，EasyTaq DN A聚合酶0.25μL，灭菌蒸馏水14.75μL。

反应条件：95℃预变性5 min，94℃变性30 s，52.5℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环35次，最后72℃终延伸10 min。

（3）动物双歧杆菌Fem AB特异引物在属分类水平的特异性检测。在NCBI数据库中查询相关信息，根据动物双歧杆菌Fem AB基因序列进行分析，设计一对特异引物（F：GGTTCGCCAAGGACATGAC，R：GATGCCGTAGAAGTCGTACAG）。然后，先对非双歧杆菌属的几种革兰氏阳性菌DNA样品使用相对应的种水平特异性引物[6-9]进行扩增鉴定，然后使用这几种鉴定无误的革兰氏阳性菌作为阴性对照，检验Fem AB特异引物在属分类水平的特异性。

PCR体系：25μL体系，DMSO 2.5μL，10×Easy-Taq Buffer 2.5μL，dNTP Mixture 2.0μL，模板DNA 1.0μL，引物F为1μL，引物R为1μL，EasyTaq DN A聚合酶0.25μL，灭菌蒸馏水14.75μL。

反应条件：95℃预变性5 min，94℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环25次，最后72℃终延伸10min。

（4）动物双歧杆菌Fem AB特异引物在种分类水平的特异性检测。使用同为双歧杆菌属下其他种的两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）、短双歧杆菌（Bifidobacterium breve）和青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）作为阴性对照，检验Fem AB特异引物在种分类水平的特异性。实验反应体系条件同（3）。

所有实验扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，并用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收，回收产物送去测序。

2　结 果

2.1　两株双歧杆菌属水平的16SrDNA通用引物鉴定

使用通用引物扩增并测序所鉴定两株菌种。结果表明两株菌种均为双歧杆菌属。

2.2　两株双歧杆菌的非特异随机引物鉴定

使用非特异随机引物XF，XR对两株双歧杆菌进行PCR扩增。如图1，两株双歧杆菌都在约100、300、800和2000bp的区域出现了四条条带。其中约800和约2000bp区域出现的条带经3，4泳道的条带分析确认为单引物扩增条带，约100区域有可能为引物二聚体，都不适合回收。

图1　两株双歧杆菌非特异随机引物扩增结果

使用回收试剂盒回收约300 bp区域的片段后进行测序，两株双歧杆菌所回收的两条约300bp片段测序结果完全一致。测序结果的Blast结果如图2所示。

图2　两株双歧杆菌非特异随机引物扩增测序部分对比结果

经NCBI的blast工具对比分析，此片段为编码双歧杆菌肽基脯氨酰异构酶（peptidylpro lylisomerase）基因序列的部分区域，而且此片段只能与动物双歧杆菌（Bifidobacterium animalis）的此基因（登录号CP009045.1）达到99%以上相似度。实验结果可以确认这两株双歧杆菌均为动物双歧杆菌。

2.3　PCR鉴定特异引物的目的基因Fem AB片段的选取与分析

革兰氏阳性菌的细胞壁结构中，除肽聚糖主链以外，还有侧链与肽桥。肽桥为革兰氏阳性菌所特有，它作为一个交联的中间结构使得革兰氏阳性菌可以形成较革兰氏阴性菌更致密的细胞壁。不同革兰氏阳性菌的肽桥的结构成分有较大的差异[10]，这提示与肽桥相关的蛋白的基因序列可能存在有较理想的种属特异性[11]，有成为可以鉴定革兰氏阳性菌的PCR特异引物的目的序列的潜力。在NCBI数据库中查找动物双歧杆菌的肽桥合成蛋白的信息，通过其查找到相关的基因编码信息（基因登录号CP007755.1，354884-356167）。根据NCBI的Blast工具分析，这段序列在所有登录在NCBI数据库中的动物双歧杆菌的相似度达97%～100%，而与其它双歧杆菌属菌种的相似度均低于75%，而与双歧杆菌属以外的菌种相似性则均约在35%以下（图3）。

图3　动物双歧杆菌Fem AB基因的Blast工具对比的部分结果

使用DN AM AN软件对动物双歧杆菌与双歧杆菌属其它菌种的Fem AB基因序列进行对比，其对比结果显示，动物双歧杆菌的Fem AB基因约1300bp的序列与其他双歧杆菌的此基因的同源性最高约75%，差异片段较分散地存在于整条序列中（图4）。

图4　几种不同双歧杆菌FemAB基因的DNAMAN工具同源性对比结果

上述几项对比的结果显示，动物双歧杆菌的Fem-AB基因序列与不同属的革兰氏阳性菌相比有着很大的差异，与其他同属菌的Fem AB基因相比也有较明显的差异。依此可以推测，Fem AB基因序列有可能成为可在属分类水平及种分类水平对动物双歧杆菌进行鉴定的PCR特异引物的目的序列。

2.4　动物双歧杆菌Fem AB特异引物在属水平的特异性检测

屎肠球菌（Enterococcus Faecium）特异引物扩增结果如图5（a），在约100～250bp的区段可见单一明亮的特异性条；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）特异引物扩增结果如图5（b），在约250～500bp的区段可见单一明亮的特异性条带；保加利亚乳杆菌（Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus）特异引物扩增结果如图 5（c），在约100-250bp附近的区段可见单一明亮的特异性条带；嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）特异引物扩增结果如图5（d），在约1 000 bp附近的区段可见单一明亮的特异性条带；两株双歧杆菌的特异引物扩增如图5（e），在约500～750bp的区段可见单一明亮的特异性条带。

图5　枯草芽孢杆菌、屎肠球菌、德氏乳杆菌、嗜热链球菌与动物双歧杆菌特异引物扩增结果

图5中，M为DL2000M aker；1为屎肠球菌菌株；2为枯草芽孢杆菌菌株；3为保加利亚乳杆菌菌株；4为嗜热链球菌菌株；5为双歧杆菌菌株1号；6为双歧杆菌菌株2号；7为无引物空白阴性对照。

图5中，各个图的作为阴性对照的菌株在各自的电泳图中在阳性菌株的特异扩增区域均无明显与之相似扩增条带。两株双歧杆菌经特异引物扩增后所回收的两条扩增片段测序结果几乎完全一致。测序后Blast对比结果如图6。

图6　动物双歧杆菌特异引物扩增测序部分对比结果

经NCBI的blast工具对比，此片段测序结果与设计完全一致，与动物双歧杆菌（Bifidobacterium animalis）的Fem AB基因（登录号CP009045.1）达到99%以上相似度。结果表明，以Fem AB为模版设计的特异引物在属分类水平上有着良好的特异性。

2.5　动物双歧杆菌Fem AB特异引物在种水平的特异性检测

使用动物双歧杆菌特异引物对一株两歧双歧杆菌、一株短双歧杆菌、两株青春双歧杆菌和本实验所分离的两株动物双歧杆菌进行扩增，扩增结果如图7，只有两株动物双歧杆菌泳道在约500-750bp处出现了特异扩增条带，其他作为阴性对照的其他双歧杆菌均未出现扩增条带。结果表明，以Fem AB为模版设计的特异引物在种分类水平上有着较好的特异性。

图7　利用动物双歧杆菌Fem AB特异引物扩增不同双歧杆菌菌种结果

3　讨 论

本实验所用的两种市售益生菌制品的说明中写明所用双歧杆菌菌株分别为长型双歧杆菌（Bifidobacteria longuMSubsp.longum）和婴儿双歧杆菌（Bifidobacteria longuMSubsp.infantis），本实验最初依据长型双歧杆菌的Fem AB基因序列设计的特异引物无任何扩增片段出现。本实验最后证明这两株菌种并非长型双歧杆菌的两个亚种菌株[12]，而是均为动物双歧杆菌。

在本研究鉴定菌种过程中借鉴了随机扩增多态性DNA（RAPD）技术[13]。某些细菌及其近缘菌中，常用于鉴定的16SrDNA序列的相似度可能会很高，在种水平上难以对其进行区分[14]。在细菌基因组中，有着较高同源性（≥90%）的保守序列实际上并不多，而大多数序列都是有带有一定特异性甚至是完全特异的基因序列[15]。如果使用特异性不高的引物进行近似于随机的扩增，其扩增出带有足够分辨种属的特异片段的概率实际上很高。

本研究中使用了针对动物双歧杆菌的Fem AB这一基因序列设计特异引物，实验结果表明，Fem AB基因在属分类水平与种分类水平上具有足够的特异性可作为PCR种属鉴定特异引物设计的目的片段。本实验使用以Fem AB为目的片段的特异引物成功建立了动物双歧杆菌的PCR检测方法，为包括双歧杆菌种属在内的其他革兰氏阳性菌的PCR检测方法的建立提供了新的思路与参考。

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