脂肪球膜中脂类的组成及测定方法

秦书云，于景华

（天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）

0　引 言

从目前市场反馈来看，脂肪上浮现象是长货架期UHT乳普遍存在的质量问题，脂肪上浮所呈现的感官质量问题，会影响消费者的购买欲望。脂肪以液滴或球状形态稳定分散于乳中，这些脂肪球被一层薄膜包裹，称为MFGM，脂肪上浮与MFGM的稳定性密切相关。现今，国内外对于MFGM脂类的研究关注较少。而脂类在MFGM中作为骨架，以流动状态存在，其变化情况直接影响乳制品的稳定性及其品质，MFGM中的脂类也具有独特的营养学意义及应用前景。因此，测定MFGM中脂类的组成对提高MFGM稳定性，解决牛乳脂肪上浮问题，提高牛乳品质及乳品工业中MFGM副产品的利用率具有重要意义。

1　MFGM中脂类的营养学意义

在MFGM中，SM是鞘脂的主要组分具有重要功能，其代谢物具有高度的生物活性，作为脂质的二级信使参与细胞的跨膜信号传导、调节生长、增殖分化和凋亡等。磷脂具有乳化、增强记忆力，预防老年痴呆，活化细胞等功能，不同种类的磷脂具有不同的功能，如PS可以提高高强度运动的能力；PC促进对记忆重要的神经递质的合成和传递，利于脑发育等。MFGM的极性脂质是具有疏水性尾部和亲水性头部的两亲性分子，一方面这大大有助于提高膜的乳化能力，在食品工业中常被用作乳化剂；另一方面在保持表皮的保水性方面起重要作用，不仅在化妆品行业中具有巨大的商业潜力，此外，还可以制备制药口服液和脂质体制剂。制作黄油时产生的副产品酪乳，价格低廉且产量高，酪乳产量约占黄油产量的1.7～1.8倍，但多年来一直被认为是无价值的。然而，酪乳的MFGM含量高，现已广泛作为研究MFGM材料的来源[1]，越来越多的研究者致力于酪乳中MFGM脂类的组成和分布的研究，定性、定量测量方法的探索。

2　MFGM中脂类的组成和分布

MFGM是由蛋白磷脂膜构成的厚度为10～20 nm的三层膜结构[2]。由磷脂和蛋白质组成的外脂双层膜结构被描述为一个流动状态的镶嵌模型，磷脂是模型的骨架，以流动状态存在，支持球状蛋白质分子，部分嵌入膜内，部分从膜内伸出，使整个脂肪球膜保持一个稳定的框架。

MFGM中脂类成分相对复杂，其成分组成、结构分布，根据不同的测定方法而略有差异，目前，尚未形成统一的定论，有待于进一步探索。

2.1　MFGM中脂类的组成成分

Carmen[3]认为MFGM中的脂质主要由甘油三酯（56%）和磷脂（40.6%）组成，还有少量的葡糖苷酰鞘氨醇(G luCer)、乳糖酰基鞘氨醇(LacCer)和痕量的溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)和溶血卵磷脂(LPC)。在磷脂中，其组成成分如下：磷脂酰胆碱（PC，31%）、磷脂酰乙醇胺（PE，30.5%）、鞘磷脂（SM，19.9%）、磷脂酰肌醇（PI，7.1%）、磷脂酰丝氨酸（PS，5%）、LacCer（3.4%）、GluCer（0.3%）。这与El-Loly[4]的研究结果非常相似，由此可以认为磷脂的测定结果有很高的可信度。

此外，El-Loly对于MFGM中极性脂质的结构也有阐述。他认为MFGM中的极性脂质主要分为磷脂类和神经鞘脂类两大类。这两类脂类都是具有疏水尾部和亲水头部的两亲性分子。磷脂的甘油骨架上有两个脂肪酸酯，第三位的羟基可以连接带有不同基团的磷酸盐残基。神经鞘脂类的特征性结构单位为长链鞘氨基醇，含2～3个羟基基团。鞘氨基醇的氨基与脂肪酸连接后形成神经酰胺，通过连接不同有机磷酸酯基团形成鞘磷脂或连接糖类后形成糖脂[5]。

2.2　MFGM中脂类的原位分布

MFGM中的脂类，尤其是磷脂的组成和分布在MFGM的构建方面发挥着重要的作用，进而很大程度上影响着MFG及整个牛乳体系的稳定性。因而，很有必要对MFGM中的脂类进行原位测定，从直观上确定MFGM的微观结构，对确立牛乳脂肪体系的稳定性与MFGM的结构框架之间的联系有重要意义。

目前，大都采用相配适的染色剂进行染色处理后的亲脂性荧光探针对MFGM中的脂类进行标记，再利用激光共聚焦显微镜（CLSM）对MFGM中的脂类进行测定。Lopez C[6]将磷脂用荧光染料R h-DOPE染色后，如图1（a）中箭头所示，分别表示M FG的核心三酰基甘油（TAG）和其周围的非荧光结构域，在图1中MFGM的结构第一次被表示为至少由两种脂相共存于MFGM中：（1）液相无序（Ld）区：甘油磷脂（PE，PC，PI，PS），蛋白质，糖蛋白；（2）液相有序（Lo）区：SM和胆固醇。刚性的Lo区被Ld区所包围。这第一次证明了极性脂质的非随机分布。同时，图1（a）～（e）中的CLSM图像可以看出，SM和胆固醇分散在MFGM中的各种大小和形状的Lo区（黑色的非荧光结构域）并发生侧向偏析。在甘油磷脂的Ld区中R h-DOPE荧光探针发射红色的荧光显示出富含SM的结构域，用小箭头表示连接富含SM的结构域的通道。由于MFGM中的脂类种类繁多，可以探索用不同的相配适的染色剂对MFGM中相应的脂类染色后再用CLSM进行观察，为以后直观观察MFGM中的脂类提供一条高可行度的实验思路，有待于进一步完善和探索。

Zou[7]将磷脂用荧光染料R d-DOPE染色后，得出了与Lopez C关于MFGM中的脂类分布相似的结论，同时阐述了这种脂类结构分布的原因。Zou认为在MFGM中作为三极体的极性脂质的极性头基团暴露于水性环境，烃尾部在双层的中心形成疏水区域或与三酰基甘油核心接触。同时，他发现甘油磷脂的分子长度小于SM分子，推测可能是由于SM具有长链饱和脂肪酸和类鞘氨醇碱的直链结构，而甘油磷脂具有不饱和脂肪酰基链的扭结结构。在MFGM双层结构中SM分子的尾部之间可能存在相互交错，胆固醇可以填充SM头部之间的空隙。但是在MFGM对称双层的两个单叶上或仅在MFGM不对称双层的外部小叶上存在富含SM的Lo区的问题仍未有定论，有待进一步研究。由于SM侧向迁移形成刚性Lo区导致MFGM的厚度存在局部差异，富含SM的Lo区从甘油磷脂结构域突出约5-9，可能是此结构域缺乏Ld区的蛋白质和糖基化分子（糖蛋白，糖脂）。因此，研究MFGM中的鞘磷脂在各种加工（加热、均质）过程中的迁移变化，可以推测出MFGM厚度的差异，对探索MFGM的结构与牛乳脂肪体系的稳定性有重要意义。

图1　Rh-DOPE探针染乳脂肪球膜结构的激光共聚焦显微图

3　MFGM中脂类的定性测定

3.1　TLC

定性测定MFGM中脂类较为常见的方法为TLC，它是利用组分分子与展开剂分子争夺吸附剂表面活性中心而将MFGM中脂类进行分离。其中，展开剂的种类对脂质分离效果的影响举足轻重，展开剂的选择主要是根据被分离物质的极性、展开剂的极性和吸附剂的活度。

Benoit[8]根据MFGM的极性脂质与非极性脂质极性大小的不同，在G 60Å的TLC硅胶板上以正己烷：乙醚：乙酸（80∶20∶1，体积比）组成的溶剂系统为展开剂，将MFGM的极性脂质与非极性脂质进行了有效分离；用C 13∶0(甘油三酯、甘油二酯、甘油一酯)做内标，以乙醚：己烷：乙酸（150∶150∶3，体积比）组成的溶剂系统作为展开剂将中性脂质的甘油三酯、甘油二酯、甘油一酯进行了较好的分离，但是并没有将MFGM的极性脂质进行细化分离。今后我们可以优化展开剂的配比，将MFGM中各种极性脂质进行分离。

2D-TLC在保留1D-TLC的几乎所有优点的基础上，扩增了峰容量，可以实现成分更为复杂的脂质的精确分离。这种方法在分离MFGM的混合脂质中也有广泛的适用性。我们可以用一种展开剂首先将混合脂中的极性脂与中性脂分离，然后再用更加精准的展开剂将两部分脂质进行深度细化分离，Bertram[3]在G 60ÅTLC板用C 13∶0(甘油三酯、甘油二酯、甘油一酯)做内标，利用氯仿∶甲醇∶水（60∶35∶5，体积比）为展开剂从板的顶部边缘到大约5 mm，分离磷脂至中途，再利用己烷：乙醚∶乙酸（70∶30∶1，体积比）为展开剂分离中性脂质[5]，这样我们用2D-TL相比1D-TLC，减少了样品处理次数，操作简便、效率高、适用性强，结果重现性高。

但是这两种方法都只能将MFGM中的脂类分离定性，无法精确测定其含量，只能通过灰度扫描仪根据分离出脂质条带的颜色深浅进行半定量。

3.2　拉曼光谱法

相比于TLC法分离鉴定MFGM中的脂类，拉曼光谱法在不破坏天然脂肪球构型的情况下进行测定，它能够从单个脂肪球获得特定拉曼信号。在拉曼光谱中观察各种脂质的拉曼峰及主要振动条带，与脂质标准品相比较，进而判定其成分及饱和度变化，进行定性分析。LUO[9]将牛奶制备成观察样品，利用拉曼光谱测定特定脂肪球及膜的脂质和脂肪酸组成。1 303和1 443 cm-1的振动条带，为特定的CH2基团的振动，对应于磷脂。875 cm-1的振动条带对应于胆碱化合物，1 630 cm-1的C=C顺式不饱和的振动对应于PC，PI和PS，可以定性地将MFGM中的脂类测定出来。拉曼光谱定性测定MFGM中的脂类的优越性在于不需要任何化学标记手段就可以实现对静态样品的快速检测。单个脂肪球分子能在天然状态下被固定，保持其天然构型，同时获得单个分子的拉曼光谱信号。然而，现有应用拉曼光谱分析MFGM中的脂类的研究较为缺乏，需要进一步探索、完善。

4　MFGM中脂类的定量测定

4.1　GC-MS

Benoit[10]利用GC-MS法，将极性脂质用氯仿∶甲醇∶水（5∶5∶1，体积比）组成的有机溶液体系萃取，再用BF3甲醇溶液进行甲基化，以H e作为载气，通过与标准品比较保留时间，计算其相对含量。测定出MFGM中磷脂组成为PC（50%），PS（40%），PI（36%），PE（25%）。另外，作者还阐述了PC具有最高的饱和脂肪酸组成，是在隔离SM和胆固醇中起主要作用的磷脂，而PE具有最低的饱和脂肪酸含量，可以加大膜的流动性。此外，Juanes[11]也利用GC-MS法，用BF-

3甲醇溶液将磷脂在石油醚中反甲基化，以H e作为载气，通过与标准品比较保留时间，计算相对含量。通过 GC-MS测定出 PC（21.2%～35.1%）；PE（19.8%～46.3%）；SM（19.8～31.4%），与Benoit测定的MFGM中脂类的组成和含量相似。说明利用GC-MS测定MFGM中的脂类可行度高，GC-MS既有GC高效分离的优点，又兼具MS特异鉴别的长处，能对混合物中已知组分进行准确的定量分析，GC-MS已成为一种高效互补的分离分析技术，应用于MFGM中的脂类测定的领域[12]。

4.2　LC-MS

Bertram[3]用磷脂标准品和正相LC洗脱的磷脂进行MS测定，来鉴定各种磷脂物质和磷脂脂肪酸组成。LC-MS法测定出MFGM脂质组分主要为甘油三酯（56%）和磷脂（40.6%），其次还有少量的乳糖基和葡萄糖脑苷脂，痕量水平的溶血磷脂酰乙醇胺和溶血磷脂酰胆碱也能检测到。这与2.1所述MFGM中脂类的组成和含量相似，此外，他也对磷脂脂肪酸组成进行测定，其中与甘油磷脂相关的脂肪酸主要是C 16∶0，C 18∶0，C 18∶1，C 18∶2，鞘磷脂中丰富的脂肪酸为C 20∶0，C 23：0，C 24∶1，C 24∶0，鞘脂基的主要脂肪酸为C 16∶1，C 17∶1，C 18∶1。另有研究表明，MFGM中甘油三酯的较高的饱和脂肪酸含量有助于维持MFGM的稳定性，因此测定牛乳在不同加工条件下，MFGM中甘油三酯的饱和脂肪酸的含量变化，可以推测MFGM和牛乳体系的稳定性。LC-MS兼具液相色谱的高分离和质谱提供结构信息的特性，具有灵敏度高、选择性强，易得丰富、有效结构信息的优点，可以提供更好的分离能力，降低分析物的检测限，并提高分析速度，从而可实现MFGM中脂类的快速、高通量分析[13]。

GC-MS具有较好的分离效率且相对较经济，但柱前衍生费时费力不能满足较大样本量的分析，且衍生产物的不稳定性不可避免。上述缺陷使它仅在分析脂肪酸上应用较多，脂肪酸的分离能力优于LC-MS，在测定复杂脂质分子上具有局限性。如MFGM中的TAG，将其衍生化后用GC-MS进行定量分析，高温易破坏TAG结构，耗时长，适用性不如LC-MS。而LC-MS，对于MFGM中脂类的测定，不经LC分离直接用MS分析常常遇到基质干扰问题。LC的模式多，适合复杂的脂类化合物的分离，且无需衍生化，LC-MS能够提供可靠、精确的相对分子质量及结构信息，具有高分辨率、高灵敏度和特异性等优点，因此，LC-MS越来越多地用于MFGM中脂类的测定中。

4.3　HPLC-ELSD

Rom baut[14]用HPLC-ELSD法分析极性脂质。以1 L/min的N2作为雾化气，在等体积条件下用氯仿/甲醇/三乙胺（87.5∶12∶0.5，体积比）缓冲液洗脱。通过与标准品的保留时间进行比较来进行极性脂质的分析。测定结果为MFGM中极性脂质组成为 PE30.23%，SM 27.36%，PC 25.2%，PI9.89%，PS7.32%。MFGM中极性脂质组成成分与2.1所述相似，但含量略有差异，不同的极性脂质具有不同的性质，极性脂质组成可以极大地影响其微观结构，因此，需要进一步完善、改进此方法在MFGM中极性脂质测定中的应用。HPLC-ELSD在MFGM中极性脂质测定中具有基线稳定、分离效果良好、结果准确、样品处理简单等优点[15]，有广泛的应用前景。

但LC-MS分析时间较长，样品在过柱中会有部分损失。HPLC-ELSD适用于分析没有紫外吸收或者吸收很弱的大分子有机化合物，也已用于MFGM中脂类的定量分析。如脑苷脂和神经酰胺，研究MFGM中脂类活性构效关系需要解析其结构，然而，MFGM中脂类的神经酰胺和脑苷脂种类繁多，难以鉴定其结构和分子种类。LC-MS虽也可对其进行测定，但需对样品进行前处理，且操作复杂、重复性差，无法具体获得每个脑苷脂和神经酰胺分子的准确结构信息，只能获得大致比例情况，不适合用于MFGM中少量鞘脂的分析。综上所述，以上3种方法在分析MFGM中的脂类中较为常用，但是每种方法都有自己的优势和局限性，需要根据MFGM中的脂类的具体性质来确定检测方法，并进一步改进和完善。

5　展 望

对于MFGM中脂类的测定方法及其结构组成的研究尚处于起步阶段。因而，需要进一步明确MFGM中脂类的组成成分和分布情况，例如通过zeta电位分析脂肪球在乳体系中的稳定性，物理反射模型的背散射光检测技术利用稳定性分析仪测定牛乳脂肪在不同处理条件下MFGM的稳定性；通过共聚焦激光显微成像和透射电镜分析等脂肪球的形态变化等；运用二次回归通用旋转组合设计方法研究均质、温度和牛乳中强化的营养素对牛乳脂肪稳定体系的影响，并建立数学模型，发现再造工艺条件与牛乳中脂肪体系稳定性之间的联系，最后通过优化工艺条件，以达到抑制牛乳中脂肪上浮和提高乳品工业富含MFGM的副产品开发潜力的目的。

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