超声提取结合高效液相色谱法检测常见食品中的吡咯素

周凯文，陈晓默，刘慧琳 ，穆琳，王静

（北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京市食品添加剂工程技术研究中心，北京工商大学，北京100048）

1912年Louis Camille Maillard发现在加热氨基酸和还原糖时会生成一种棕色混合物[1]，因此后来将氨基和羰基化合物之间的反应称为美拉德反应（Maillard reaction），美拉德反应在为食品提供香气、色泽的同时也会生成一些对人体有害的化合物，如晚期糖基化终产物（Advanced glycation end products，AGEs），AGEs形成于美拉德反应的后期阶段，是一类稳定的化合物，包括吡咯素（ε-2-甲酰基-5-羟甲基-1-吡咯-L-亮氨酸，Pyrraline）、羧甲基赖氨酸（Nε-carboxymethyllysine，CML）、羧乙基赖氨酸（Nε-carboxyethyllysine，CEL），丙烯酰胺（acrylamide，AA）等等，AGEs可以通过膳食进入人体内并在人体内积累，研究表明，在西方饮食中，人类每天大概摄入25 mg～75 mg AGEs，主要是CML和吡咯素[2]，AGEs在人体内的积累会导致氧化应激，进而会引起一系列的慢性疾病，同时也会加速机体的衰老[3]。大量的临床实验和动物实验也表明，吡咯素在人体的积累与一些慢性疾病有着密切的关系[4-5]。吡咯素作为美拉德反应后期阶段的重要标志物，也作为AGEs定量检测的重要化合物，受到学者的广泛关注。

超声提取是一种新型的辅助提取法，现已广泛用于生物、化学和食品行业。主要是通过热效应、机械效应和空化效应[6]破碎细胞壁和细胞膜，从而溶解待提取成分，并进一步分离。超声提取目前主要用于多糖[7-8]、多酚[9]以及黄酮等物质的提取[10]，本实验首次利用超声提取法提取食品中的吡咯素，结合高效液相色谱（High performance liquid chromatography，HPLC）检测不同食品中的吡咯素，具有操作简单快速易行的特点，检测了牛奶、奶酪、果蔬干、坚果、饼干、酱油、奶粉、面包、火腿和咖啡等常见食品中游离吡咯素的含量，对减少食源性AGEs的摄入有一定的指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牛奶、奶酪、果蔬干、坚果、饼干、酱油、奶粉、面包、火腿、咖啡：永辉超市；乙腈、三氟乙酸（均为色谱纯）：北京百灵威科技有限公司；无水甲醇（分析纯）：西陇化工股份有限公司；氨水（分析纯）：国药集团化学制剂有限公司。

CR22N高速冷却离心机：日立工機㈱有限公司；SHB-III循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；LC-20A高效液相色谱仪：岛津（中国）有限公司；KQ-700GVDV三频恒温数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；PT2500 E匀浆机：瑞士Buchi（布奇）公司；R-210旋转蒸发仪：瑞士Buchi（布奇）公司。

1.2 实验方法

1.2.1 超声条件的优化

1.2.1.1 料液比的优化

称取8 g奶粉，分别分散于40、80、160 mL甲醇（含5%氨水）中，使料液比为1∶5、1∶10、1∶20（g/mL）。在温度为45℃，频率为80 KHz条件下超声30 min后，5 590 r/min条件下离心10 min，在40℃下旋转蒸干后，复溶于2 mL超纯水中，利用HPLC法进行检测。

1.2.1.2 超声频率的优化

称取8 g奶粉，分散于80 mL甲醇（含5%氨水）中，在温度为45℃，频率分别为45、80、100 KHz条件下超声30 min后，5 590 r/min条件下离心10 min，在40℃下旋转蒸干后，复溶于2 mL超纯水中，利用HPLC法进行检测。

1.2.1.3 时间的优化

称取8 g奶粉，分散于80 mL甲醇（含5%氨水）中，在温度为45℃，频率为80 KHz条件下分别超声15、30、45、60 min 后，5 590 r/min 条件下离心 10 min，在40℃下旋转蒸干后，复溶于2 mL超纯水中，利用HPLC法进行检测。

1.2.1.4 温度的优化

称取8 g奶粉，分散于80 mL甲醇（含5%氨水）中，在温度分别为25、45、75℃，频率为80 KHz条件下超声30 min后，5 590 r/min条件下离心10 min，在40℃下旋转蒸干后，复溶于2 mL超纯水中，利用HPLC法进行检测。

1.2.2 实际样品预处理方法

准确称取或量取牛奶、奶酪、果蔬干、坚果、饼干、酱油、奶粉、面包、火腿和咖啡等实际样品各8 g或8 mL于50mL离心管中，根据方法1.2.1确定的最优料液比加入相应体积的提取剂后，用匀浆机搅拌成匀浆，并进行超声处理，而后将提取剂进行旋转蒸干后，复溶于2 mL超纯水中，用HPLC进行检测。

1.2.3 HPLC法检测吡咯素

1.2.3.1 配制吡咯素标准溶液

准确称取吡咯素纯品，配制成浓度为2mmol/L的母液。用超纯水将母液稀释成以下浓度的标准溶液：0.000 5、0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1 mmol/L，并放入离心管中，于4℃冰箱保存备用。

1.2.3.2 HPLC条件

根据Portero-Otin法[4]，并做一定的修改，采用In-ertsil ODS-SP 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相 A 为0.1%TFA的水溶液，流动相B为乙腈水溶液（体积比=1 ∶1），梯度洗脱程序为 1 min～10 min，0%～15%B；10 min～30 min，15%～20%B；30 min～35 min，20%～100%B；35 min～40 min，100%～0%B；40 min～45 min，0%B，流速为 1.0 mL/min；进样量为 5 μL；检测波长为297 nm。

1.3 数据处理与分析

运用Excel 2007软件进行数据分析和图形的绘制，Spss 17.0软件进行数据的显著性分析。

2 结果与分析

2.1 超声提取条件的优化

超声提取能通过热效应、机械效应和空化效应[6]破碎细胞壁和细胞膜，从而溶解待提取成分，并进一步分离。影响提取效果的主要因素是超声波强度、声波频率、液体的表面张力、黏滞系数以及温度和提取时间。本文选取对吡咯素提取量影响较大的4个因素，分别为料液比、超声频率、超声时间和温度。料液比对吡咯素提取量的影响见图1。

图1 料液比对吡咯素提取量的影响Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on the pyrraline yield

从图 1可以看出，料液比达到 1∶10（g/mL）时，奶粉中吡咯素的提取量达到最大值。当保持其它条件不变时，随着料液比逐渐增加，细胞内外的浓度梯度增大，更有利于吡咯素的溶出，当料液比达到1∶10（g/mL）后，当溶剂再增加时，吡咯素的提取量反而下降，原因可能是奶粉中的其他物质溶解，阻碍了吡咯素的溶出，从而使吡咯素的提取量降低[11]。超声频率对吡咯素提取量的影响见图2。

从图2可以看出，当超声频率达到80 KHz时，奶粉中吡咯素的提取量达到最大值。当保持其它条件不变时，随着超声频率逐渐增加，导致机械效应和空化效应增加，能更有效的破坏细胞膜和细胞壁，有利于吡咯素的溶出，增加吡咯素的提取量，但是当频率过高时会引起热效应，导致提取液中氨气的挥发，从而降低了吡咯素的提取量。超声时间对吡咯素提取量的影响见图3。

图2 超声频率对吡咯素提取量的影响Fig.2 Effect of ultrasonic frequency on the pyrraline yield

图3 超声时间对吡咯素提取量的影响Fig.3 Effect of ultrasonic time on the pyrraline yield

从图3可以看出，当提取时间为30 min时，奶粉中吡咯素的提取量达到最大值。当保持其它条件不变时，随着提取时间的增加，奶粉中的吡咯素提取量逐渐增加，当提取时间达到30 min后，吡咯素的提取量反而下降。由动力学方程可知，提取时间越长，提取量越大，但增大幅度会下降[12]，继续增加提取时间，提取量反而会下降。原因可能是提取时间的增加会导致热效应，从而引起提取液中氨气挥发，降低了吡咯素的提取量。超声温度对吡咯素提取量的影响见图4。

图4 超声温度对吡咯素提取量的影响Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on the pyrraline yield

从图4可以看出，当提取温度为45℃时，奶粉中吡咯素的提取量达到最大值。当保持其它条件一定时，随着提取温度的增加，吡咯素的提取量增加，因为温度的升高，加快了分子的运动速度，有利于扩散传质。当温度达到45℃后，吡咯素的提取量下降，原因是温度过高导致提取液中的氨气挥发，影响吡咯素的提取。

因此选择最优超声提取条件为料液比1∶10（g/mL），时间 30 min，温度 45 ℃，频率 80 KHz，此条件下测得的奶粉中吡咯素的含量为0.58 μg/g奶粉。

2.2 HPLC法测定不同食品样品中吡咯素的含量

固态、液态食品样品中游离吡咯素的含量见表1、表2。

表1 固态食品样品中游离吡咯素的含量Table 1 The content of free pyrraline in solid food samples

续表1 固态食品样品中游离吡咯素的含量Cotinue table 1 The content of free pyrraline in solid food samples

表2 液态食品样品中游离吡咯素的含量Table 2 The content of free pyrraline in liquid food samples

由表1、2可知，牛奶、奶酪、果蔬干、坚果、饼干、酱油、奶粉、面包、火腿肠和咖啡中均检测到了吡咯素，其中酱油和咖啡中吡咯素的含量较其他食品中高，最高可达18.42 μg/mL酱油、11.27 μg/g咖啡。因为酱油是发酵型产品，在发酵过程中蛋白质、淀粉等大分子物质经微生物发酵生产各种小分子物质，游离的氨基酸和还原糖增加[13]，所以导致酱油中游离的吡咯素要比其它食品中含量高，卞华伟等对不同种类的食品中CML的含量进行测定，结果表明，老抽中的CML的含量较其它食品中高，达到了（796.35±24.67）μg/mL 食品[14]。咖啡豆经过适当的烘焙处理，可引发咖啡豆中多糖、脂肪、蛋白质发生美拉德反应[15]，生成挥发性呈香物质，如吡咯类、醛酮类等等[16]，其中3-DG是形成吡咯素的前体物质。液态牛奶中吡咯素的含量为（0.15±0.00）μg/mL～（0.31±0.03）μg/mL 样品，奶粉中吡咯素的含量为（0.13±0.00）μg/g～（1.71±0.00）μg/g 样品，牛奶中的蛋白质主要以大分子的形式存在，因此游离的吡咯素含量较少，而全脂牛奶中吡咯素的含量较高，因为全脂牛奶中脂肪的含量高，Han等人研究表明油脂能够引发·OH的产生[17]，可能会导致吡咯素生成量的增加。面包和饼干中蛋白质也主要以大分子的形式存在，因此游离的吡咯素含量较低。奶酪和坚果中油脂和蛋白的含量高但是碳水化合物的含量很低[18]，因此吡咯素的含量较低。而果蔬干中碳水化合物的含量很高，但是油脂和蛋白的含量较低，因此吡咯素的含量也相对较少。类似的，黄油和奶酪火腿肠中吡咯素的含量比其他种类的火腿肠高。

3 结论

采用超声提取结合HPLC法对不同的食品样品中游离吡咯素进行测定，不同来源的食品中吡咯素的含量有很大的差异，酱油和咖啡中吡咯素的含量最高可达18.42 μg/mL酱油和11.27 μg/g咖啡，而其他食品中吡咯素的含量相对较少，主要是因为蛋白质主要以大分子物质的形式存在，因此游离的吡咯素含量较少。

[1]Maillard L C.Action of amino acids on sugars formation of melanoidins in a methodical way[J].Comptes rendus Chimie,1912,154:66-68

[2]Henle T.AGEs in foods:do they play a role in uremia?[J].Kidney international,2003,63:S145-S147

[3]Sharma C,Kaur A,Thind S S,et al.Advanced glycation end-products(AGEs):an emerging concern for processed food industries[J].Journal of food science and technology,2015,52(12):7561-7576

[4]Portero-Otin M,Nagaraj R H,Monnier V M.Chromatographic evidence for pyrraline formation during protein glycation in vitro and in vivo[J].Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Protein Structure and Molecular Enzymology,1995,1247(1):74-80

[5]Sengl M,Ledl F,Severin T.Maillard-reaktion von rinderserumalbumin MIT glucose hochleistung-flüssigkeitschromatographischer nachweis des 2-formyl-5-(hydroxymethyl)pyrrol-1-norleucins NACH alkalischer hydrolyse[J].Journal of Chromatography A,1989,463:119-125

[6]万水昌,王志祥,乐龙,等.超声提取技术在中药及天然产物提取中的应用[J].西北药学杂志,2008(1):60-62

[7]辛明慧,张荣华,杨丽,等.响应面法优化辣木中多糖和芦丁的超声提取工艺[J].中成药,2017(3):625-628

[8]宋思圆,苏平,王丽娟,等.响应面试验优化超声提取黄秋葵花果胶多糖工艺及其体外抗氧化活性[J].食品科学,2017(2):283-289

[9]刘杨,赵婧,梁莉,等.响应面优化蒲公英多酚超声波辅助乙醇提取工艺及其抗氧化性[J].食品工业科技,2017(2):287-292

[10]高宁,张婷婷,张薇,等.Plackett-Burman设计和响应面法优化黑果小檗果实总黄酮超声提取工艺[J].新疆医科大学学报,2017(4):494-497

[11]李珍,哈益明,李安,等.响应面优化苹果皮渣多酚超声提取工艺研究[J].中国农业科学,2013,46(21):4569-4577

[12]徐菊茂.杭白菊中黄酮类成分的提取动力学研究[J].中国药业,2012,21(16):31-32

[13]高献礼.高盐稀态酱油在发酵和巴氏杀菌过程中风味物质形成和变化的研究[D].广州:华南理工大学,2010

[14]卞华伟,李玉婷,李冰,等.国内常见食品中羧甲基赖氨酸含量分析[J].现代食品科技,2014,30(11):223-228

[15]Petisca C,Pérez-Palacios T,Farah A,et al.Furans and other volatile compounds in ground roasted and espresso coffee using headspace solid-phase microextraction:Effect of roasting speed[J].Food and Bioproducts Processing,2013,91(3):233-241

[16]Altaki M S,Santos F J,Galceran M T.Occurrence of furan in coffee from Spanish market:contribution of brewing and roasting[J].Food chemistry,2011,126(4):1527-1532

[17]Han L,Li L,Li B,et al.Hydroxyl radical induced by lipid in Maillard reaction model system promotes diet-derived N ε -carboxymethyllysine formation[J].Food and chemical toxicology,2013,60:536-541

[18]Assar S H,Moloney C,Lima M,et al.Determination of Nε-(carboxymethyl)lysine in food systems by ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry[J].Amino acids,2009,36(2):317-326