针刺对慢性脑缺血大鼠三叉神经脊束核神经元钙通道Cav1.3表达及凋亡的影响*

郭 森，魏 萌，杨松鹤，乔跃兵、2

（1.承德医学院人体解剖学教研室，河北承德 067000；2.沧州医学高等专科学校）

针剌是中国传统医学特有的一种治疗手段，大量临床和实验研究都已证明，针刺可通过抑制炎性反应、减轻氧化应激损伤、减少细胞凋亡、促进脑血管再生等途径保护神经元[1-3]。也有研究指出[4]，电针刺激“四白”穴可以诱发大鼠三叉神经脊束核神经元中有衣小泡的产生，有衣小泡在神经元发育及对抗损伤的过程中都发挥了重要作用[5-6]，但作用机制仍不明确。本研究通过观察针刺脑缺血大鼠“四白”穴后三叉神经脊束核中钙通道Cav1.3蛋白表达的变化和神经元的凋亡情况，探讨脑损伤后电针作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 Wistar大鼠，雄性，200g-220g。36只大鼠随机分为3组，针刺组、缺血对照组和假手术组，每组12只。针刺组和缺血对照组大鼠阻断左侧颈总动脉和双侧椎动脉建立模型，假手术组只暴露相应动脉不予阻断；针刺组大鼠于阻断血管24h后给予针刺处理。

1.2 主要设备及试剂 G6805-2A型电针治疗仪（上海华谊医用仪器厂），H7650透射电子显微镜（日本日立公司），冰冻切片机（美国Thermo Scientific公司）；兔源性抗Cav1.3抗体（美国Abcam公司），TUNEL试剂盒（瑞士罗氏公司）。

1.3 大鼠慢性脑缺血模型的制备 大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉（300mg/kg），仰位固定，颈部正中切口，暴露左侧颈总动脉并结扎切断；大鼠俯位固定，颈部后正中线切口，暴露第一颈椎横突孔，电凝双侧椎动脉。

1.4 大鼠针刺方法 针刺组大鼠于阻断血管24h后给予针刺处理。于大鼠第二排刚髭中间处[6]（相当于人的“四白”穴）刺入电针，接通电针治疗仪，选择疏密波（40Hz/s，输出电压5V），连续针刺3h，1次/天，针刺15天。

1.5 标本的采集及指标检测 每组12只大鼠，随机选取其中的6只用于制作光镜标本，其余6只用于制作电镜标本。

1.5.1 光镜标本的采集及指标检测：大鼠于腹腔内注射10%水合氯醛麻醉（300mg/kg），4%多聚甲醛400ml固定，取出第四脑室底髓纹至枕骨大孔部分的脑组织，后固定过夜，30%蔗糖浸至下沉后行冠状切面冷冻切片（厚20μm）。

⑴免疫组织化学染色：采用免疫组织化学染色法检测钙通道Cav1.3蛋白的表达，一抗工作浓度1：200，DAB显色，以神经元胞质内有黄褐色颗粒为Cav1.3阳性神经元。采用Image-Pro Plus 6.0软件进行定量分析，用三叉神经脊束核内染色的平均光密度（OD）值作为钙通道Cav1.3蛋白相对表达量的指标。

⑵神经元凋亡的检测：按TUNEL试剂盒提供的实验步骤进行操作，D A B显色。细胞中有黄褐色颗粒者为TUNEL阳性细胞，即凋亡神经元。每只大鼠随机选取10个200倍光镜视野，以10个视野内阳性细胞的平均值，作为该大鼠凋亡神经元的数量。

1.5.2 电镜标本的采集及染色：大鼠腹腔内注射10%水合氯醛麻醉（300mg/kg），4%多聚甲醛、1%戊二醛混和液400ml固定，取出延髓，参照《大鼠脑立体定位图谱》切取三叉神经脊束核部分。所得标本于25%戊二醛中固定4h，0.1mol/L的PBS冲洗5次，1%锇酸固定2h，0.1mol/L的PBS漂洗12h，丙酮梯度脱水，Epon812浸透包埋，超薄切片，铀铅染色。

1.6 统计分析 采用SPSS 19.0软件进行统计分析。各组间计量资料的比较采用单因素方差分析，各组间两两比较采用q检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠三叉神经脊束核钙通道Cav1.3蛋白的表达针刺组大鼠三叉神经脊束核钙通道Cav1.3蛋白表达明显高于缺血对照组，但仍低于假手术组，组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见附表：

附表 各组大鼠三叉神经脊束核钙通道Cav1.3蛋白表达和神经元凋亡情况（± s，n=6）

附表 各组大鼠三叉神经脊束核钙通道Cav1.3蛋白表达和神经元凋亡情况（± s，n=6）

与假手术组比较：*P＜0.05；与缺血对照组比较：△P＜0.05

组别 Cav1.3蛋白表达 神经元凋亡数量假手术组 173.76±7.52 5.35±0.82缺血对照组 119.51±6.17* 17.15±1.27*针刺组 136.9±6.52*△ 12.07±1.35*△

2.2 各组大鼠三叉神经脊束核神经元凋亡情况 各组大鼠三叉神经脊束核内均可检测到凋亡神经元，神经元凋亡数量：缺血对照组＞针刺组＞假手术组，各组间凋亡神经元数量比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。见附表。

2.3 各组大鼠三叉神经脊束核尾侧亚核神经元超微结构观察 假手术组大鼠，神经元细胞核核膜完整，核内染色质均匀；胞质内粗面内质网发达，排列规则，线粒体丰富（图1）。缺血对照组大鼠，细胞核变形，核膜内陷形成核袋或假包涵体（图2）。针刺组大鼠，神经元缺血性改变较缺血对照组轻；神经元细胞核形态较规则（图3）；在胞质内可见到有衣小泡，多呈圆形，质膜外多附有毛刺状外衣，大部分有衣小泡位于细胞膜附近（图4）。

附图 大鼠三叉神经脊束核尾侧亚核神经元超微结构

3 讨论

L-型钙通道Cav1.3是电压依赖性钙通道，在中枢神经系统分布广泛，参与钙稳态、激素分泌和基因表达等多种功能的调控[7-8]。以往认为，神经元缺血后L型钙通道的开放是导致细胞内Ca2+超载及神经元死亡的重要因素[9]。但随着对神经元缺血损伤研究的不断深入，人们发现细胞内Ca2+浓度降低同样可以导致神经元凋亡，尤其是在慢性脑缺血的过程中，L-型钙通道表达的减少也是造成神经元凋亡的重要因素[10]。因此，对缺血后神经元L-型钙通道的保护可能成为减少神经元凋亡的有效手段。

针剌作为中国传统医学特有的一种治疗手段，目前已经广泛地应用于缺血性脑血管疾病的治疗，且已被证明可通过减轻氧化应激损伤、减少细胞凋亡、促进脑血管再生等途径在缺血性脑血管疾病中发挥保护神经元的作用[1-3]。孔祥玉等发现[4]，电针刺激大鼠“四白”穴可诱发三叉神经脊束核神经元中有衣小泡的产生，这些有衣小泡的形成主要与神经元发育和对抗损伤因素的某些过程有关。本研究超微结构观察亦发现了有长小泡的产生。另外，本研究还观察了针刺后慢性脑缺血大鼠三叉神经脊束核神经元钙通道Cav1.3表达的改变及神经元的凋亡情况，结果显示，针刺组大鼠三叉神经脊束核神经元钙通道Cav1.3蛋白的表达明显高于缺血对照组、凋亡神经元数量明显低于缺血对照组。考虑可能机制为，电针诱发产生的有衣小泡介导了细胞膜钙通道Cav1.3在不同神经元之间的交换和循环，防止了受缺血影响较严重的神经元钙通道Cav1.3表达的过度减少，进而阻止神经元钙稳态的破坏和凋亡的发生。

综上所述，针刺虽能抑制大鼠脑缺血后三叉神经脊束核神经元钙通道Cav1.3表达的减少和神经元凋亡，但具体机制仍需进一步探索。

【参考文献】

[1]王守岩，马贤德，王哲，等.眼针对大鼠急性脑缺血再灌注损伤脑组织ICAM-1表达的影响[J].北京中医药大学学报，2012，35(1)：38-41.

[2]闫明茹，郑宇，孙洁，等.不同时机介入醒脑开窍针刺法对脑缺血再灌注大鼠SOD活性和MDA含量的影响[J].现代生物医学进展，2013，13(10)：1887-1891.

[3]王春霞，孙远征.头穴丛刺法对慢性脑缺血大鼠海马血管内皮生长因子表达的影响[J].针刺研究，2012，37(5)：375-379.

[4]孔祥玉，赵淑敏，张书琴.针刺过程中有衣小泡的形成、形态特征及其数量变化的研究[J].神经解剖学杂志，1993，9(1)：39-45.

[5]Eckenhoxff MF,Pysh JJ.Double-walled coated vesicle formation:evidence for massive and transient conjugate internalization of plasma membranes during cerebellar development[J]. J Neurocytol,1979,8(5): 623-638.

[6]乔跃兵，马秀艳，孔祥玉，等.延长针刺时间大鼠三叉神经脊束核尾侧亚核非突触部位胞吐数量的变化[J].中国临床康复，2006，10(35)：78-80

[7]Hirtz JJ, Boesen M, Braun N, et al. Cav1.3 calcium channels are required for normal development of the auditory brainstem[J].J Neurosci,2011,31(22):8280-8294.

[8]Núñez-Santana FL, Oh MM, Antion MD, et al. Surface L-type Ca2+channel expression levels are increased in aged hippocampus[J]. Aging Cel,2014,13(1):111-120.

[9]王金华，刘佩芳.丹参酮ⅡA对脑缺血再灌注损伤大鼠神经元L-型钙通道表达的影响[J].中国中医药科技，2008，15(6)：442-443.

[10]郭森，朱江，王永为，等.丁苯酞对缺血大鼠大脑皮质中钙通道Cav1.3表达的影响[J].中风与神经疾病杂志，2016，33(1)：38-41.