胰腺癌与凝血相关因素的研究进展

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(1复旦大学附属中山医院介入治疗科 上海 200032; 2上海市影像医学研究所 上海 200032)

1865年Trousseau首次报道胃癌患者易发静脉血栓,恶性肿瘤的一个严重而常见的并发症是栓子形成,所以后来将这种患者所并发的自发性反复发作性或游走性静脉血栓和动脉血栓称为Trousseau综合征。越来越多的研究证实肿瘤患者体内形成血栓的危险性明显增加,达到正常人的2～7倍[1-2]。肿瘤患者的高凝状态是深静脉血栓(deep vein thrombosis,DVT)形成的重要原因。多种肿瘤患者均存在凝血状态异常,表现在凝血功能的指标或多或少都存在异常,尤其在胰腺癌患者中,这种高凝状态更为明显,表现为D-二聚体、纤维蛋白原和(或)纤维蛋白降解产物及血小板不同程度的增高。在多种恶性肿瘤中,DVT形成比值最高的是胰腺癌,继之为头颈部肿瘤;另外腺癌较鳞癌、组织学分级中级别高的恶性肿瘤较级别低者更容易形成静脉血栓[3-4]。在一些研究中,约有50%以上的胰腺癌患者存在着DVT[5],DVT造成的肺动脉栓塞以及弥漫性血管内凝血是除胰腺癌本身外的重要致死原因。是什么导致了胰腺癌的高凝状态,这种高凝状态与胰腺癌之间有何关系,对胰腺癌的恶性程度、侵袭和转移以及预后有何作用,如何应对这种高凝状态,都是值得我们研究的问题。本综述从胰腺癌的高凝状态产生的原因、机制,高凝状态对于胰腺癌的发展和转移的作用,并且在预防和治疗方面的研究进展进行阐述。

胰腺癌与组织因子(TF) 目前研究发现组织因子(tissue factor,TF)是胰腺癌患者发生血栓形成最主要的原因。TF亦称凝血因子Ⅲ,是一种糖蛋白受体,为细胞表面表达的跨膜蛋白,通过外源性凝血途径激发凝血过程,其作为凝血因子Ⅶ的受体,它与Ⅶ因子结合促使其转化为有活性的Ⅶa因子,并形成TF/Ⅶa 复合体,该复合体可将无活性的凝血因子Ⅹ水解为有活性的Ⅹa因子,Ⅹa与Ⅴa相结合并在活化的血小板的磷脂膜表面将凝血酶原酶解为凝血酶,启动外源性凝血过程。因此TF是止血的核心和关键因素。越来越多的证据也表明,TF能通过调控血管生成,从而促进肿瘤的生长及肿瘤转移[6-7]。上皮细胞、巨噬细胞、单核细胞、血小板和纤维母细胞的基础TF表达都很低,但是在炎症的刺激下,TF可以在这些细胞表面过表达[8]。在肿瘤的刺激下,这些细胞的TF表达亦明显增加[9]。肿瘤细胞本身也会表达TF,研究发现在胰腺癌、结直肠癌和乳腺癌细胞中TF表达水平明显升高,并且其水平与癌症的侵袭表型相关[10]。在胰腺癌活检组织检测中亦发现TF表达的升高与患者DVT发生率有很大的相关性,并且在发生血栓的胰腺癌患者血浆中的TF浓度明显上升,越来越多的文献肯定了这一现象[11-13]。TF的表达还与胰腺癌的恶性程度及侵袭转移能力相关,Echrish等[14]和Gerotziafas等[15]在人胰腺癌BX-PC3细胞TF的表达研究中指出,TF与其在体外促发正常人体血浆的凝血酶生成能力有一定的关联性,BX-PC3细胞的促凝活性与TF的表达的量有关,高表达的TF与细胞侵袭能力呈正相关。

TF在胰腺癌中高表达的可能相关因素组织因子途径抑制物(tissue factor pathway inhibitor,TFPI)是TF、Ⅶ因子和Ⅹ因子的天然抑制物,在维持正常凝血中发挥关键的生理作用。胰腺癌患者TFPI的表达下降,是TF高表达的一个原因。导致胰腺癌患者TFPI表达下降的原因目前未明,需进一步研究。TFPI的变化可以作为早期诊断胰腺癌的一项依据,如Balasenthil等[16]检测不同级别的胰腺导管腺癌的TFPI/TNC-FN III-C 及CA 19-9指标发现结合三者可以对早期胰腺癌的诊断有一定帮助。TPFI-2是TPFI的一种结构类似物,是近年来发现的一种丝氨酸蛋白酶抑制物,能明显抑制胰腺导管腺癌中的MMPs活性和功能,从而抑制了肿瘤的侵袭转移、血管生成及诱导细胞凋亡等过程[17]。研究表明外源性TFPI-2基因能够抑制胰腺癌细胞生长、诱导胰腺癌细胞凋亡,可能具有抑制肿瘤细胞增殖的作用[18]。

与肿瘤相关的一些致癌基因或抑癌基因的突变可能会引起TF异常表达,如K-ras原癌基因,C-MET基因和p53突变,p53突变后失去抑癌功能,导致丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)和磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)信号通路的不断激活,进而引起TF表达升高[19-20]。

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)通过激活NF-κB的活性,诱导MMP-9表达,促进胰腺癌细胞的侵袭,从而TF的表达升高。持续活化的EGFR-Ⅲ突变形式也被证明调控TF的表达。上皮间质转化(epithelialtomesenchymal transition,EMT)以及伴随的E-钙黏蛋白的失活可能进一步促进EGFR诱导的TF表达[21]。

肿瘤细胞还可能通过组织缺氧而调控TF表达。缺氧导致的TF表达主要依赖早期生长反应基因1(early growth response gene-1,Egr-1)而不是依赖缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)[22]。肿瘤在生长过程中,中央部分组织由于供血不足而出现缺氧坏死,使坏死组织周边的细胞中TF表达增高。最近的文献表明缺氧使人类的足突细胞核因子NF-κB依赖性的TF表达升高[23]。

肿瘤细胞可以通过分泌某些促炎细胞因子及促血管生成因子包括血管内皮生长因子(vascular endothelial factor,VEGF)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、β-纤维母细胞生长因子(β fibroblast growth factor,β-FGF)和血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)等,刺激相关细胞(肿瘤细胞,吞噬细胞,血小板等)上调TF的表达,促进高凝状态、肿瘤生长和血管形成,进而使肿瘤侵袭性增加[24]。

目前研究已发现多种可以调控TF表达的通路和基因[25],然而对于受TF调控的下游通路和基因的研究却很少;另一方面,如何利用TF在肿瘤组织中高表达的特性研究抑制的相关药物,还需要进一步的深入。

胰腺癌与D-二聚体的关系D-二聚体是在纤溶酶的作用下,交联纤维蛋白产生的一种特异性降解产物,能反映体内存在血凝状态及纤溶亢进的情况,可作为相关的特异分子标志物。实验证明多种恶性肿瘤患者均存在着凝血和纤溶功能的异常,并且普遍存在D-二聚体明显升高的情况。显示当肿瘤发生转移的情况下,体内的高凝状态将加剧,交联纤维蛋白的降解会明显增强[26]。肿瘤患者D-二聚体产生可能的机制是肿瘤细胞出现坏死、脱落,继而产生黏附、聚集,促使正常细胞坏死,释放促凝血物质;另外肿瘤细胞可分泌纤维蛋白原激活物;在肿瘤因子的刺激和放疗、化疗的应用,激活凝血因子和(或)血小板,致使凝血活性增强,凝血亢进继发性纤溶亢进,血中D-二聚体的水平明显升高。D-二聚体对于肿瘤良恶性有辅助诊断价值,而且与肿瘤的分级、分期有关,高血浆D-二聚体可作为一个晚期实体癌症患者的标志物。越来越多的证据表明,D-二聚体可作为对化疗反应和生存的独立预后因子。除了对疾病的临床分期、肿瘤组织学类型之外,血浆D-二聚体还可以独立预测生存。高D-二聚体水平的恶性肿瘤患者总生存差,死亡风险明显增加[27-28]。在对胰腺癌患者的D-二聚体研究中,Durczyński等[29]发现胰腺癌患者门脉血的D-二聚体水平明显高于外周血,并且他们在进一步的研究中指出,一些认为可切除的胰头癌患者如果存在血中高D-二聚体水平,可能存在着肝转移,这些患者最好在切除前行腹腔镜诊断,避免不必要的剖腹探查。因此在术前检查血浆中的D-二聚体水平对预测胰头癌的可切除性有一定的帮助[30]。

凝血过程与胰腺癌的血管生长的关系既往的观点认为胰腺癌是乏血供肿瘤,但Lomberk等[7]认为胰腺癌是一种血管生长依赖性的肿瘤,血管生长的加快也可以提示其预后不佳。在一系列的凝血过程中,不管是内源性的凝血途径还是外源性的凝血途径,都可能刺激VEGF的表达,从而促进肿瘤的血管生长、侵袭和转移。TF可激活外源性凝血系统导致凝血酶的生成,凝血酶可通过活化多种信号转导机制促进肿瘤新生血管生成和肿瘤转移。凝血酶主要与G蛋白耦联的受体—蛋白酶激活受体-1(protein-activated receptor-1,PAR-1)相结合,活化细胞内p42/p44、有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK),启动VEGF的转录,促进肿瘤新生血管的形成[31-32]。

胰腺癌与血细胞的关系目前普遍认为肿瘤患者体内的血细胞(包括白细胞,红细胞,血小板)会伴随病情的不同而发生变化,这一变化不仅在于给患者行抗肿瘤治疗之后,在诊断之初也会不同程度地发生数量或质量上的变化。白细胞在肿瘤患者中普遍升高,Thomson等[33]发现恶性肿瘤患者中性粒细胞的百分比相比良性肿瘤的高。Khorana等[34]首次提出白细胞计数的升高也预示着DVT形成的风险增大。而在以中性粒细胞升高为主的肿瘤患者中,DVT发生的风险更大[35]。血小板是凝血机制中最重要的直接参与者。在临床中可见多数胰腺癌患者合并血小板计数增多,进而导致血栓疾病,在晚期胰腺癌患者中更普遍。Riedl等[36]在大量文献综述中列举了血小板的多种功能及与恶性肿瘤的各种关系,血小板可以分泌、释放内部颗粒和生长因子,如PDGF、转化生长因子、VEGF、凝血酶、纤维蛋白原等,促进肿瘤血管生成及肿瘤生长。

体内多种细胞也会在肿瘤的刺激下,分泌出一些高促凝物质,如组织因子相关微粒(TF-bearing MPs),即所谓的膜微粒(membrane microparticles,MPs),在细胞受到刺激或者是细胞在凋亡时,细胞膜的不对称性遭到破坏,使细胞膜外层的磷脂酰丝氨酸暴露,这些磷脂酰丝氨酸带负电荷,进而细胞骨架及蛋白构架发生改变,最终,小囊泡从细胞膜脱落形成MPs。有大量研究显示,当单核细胞、内皮细胞、血小板等受到肿瘤细胞刺激时,能表达释放出含有TF的微粒[37],其中主要由血小板释放,这些微粒有明确的TF相关促凝血活性,当血液中表达循环TF的微粒水平升高时,血液也表现出高凝状态[38]。在肿瘤大鼠模型中,TF抗原与肿瘤大小密切相关,增高的肿瘤衍生的微粒水平与升高的凝血-抗凝血混合物水平密切相关。这些研究强有力地证实了TF-MPs在许多疾病中促进了血栓的形成。在多个关于TF相关微粒与胰腺癌的临床和实验室研究中,提示TF相关微粒血浆水平的升高,胰腺癌患者存在DVT的风险更大,TF相关微粒可能是胰腺癌患者更易出现血栓形成的一个原因[39-40]。

胰腺癌患者本身基础疾病与治疗措施与血栓形成与胰腺癌患者密切相关的危险因素包括年龄(高龄)、性别、体形(胖瘦)、种族,既往有无血栓病史以及基础疾病如糖尿病、高血压、肾脏和肝脏疾病等,其中如有既往血栓病史则再次血栓的风险增加,这些基础疾病在恶性肿瘤患者中更显著[41]。伴有感染的恶性肿瘤患者发生静脉血栓的概率可以是非感染者的3倍[42]。

胰腺癌治疗的各种相关措施,如手术切除、放化疗、免疫及生物学治疗(如抗血管新生药物、红细胞生成素、集落刺激因子)、激素治疗、肠外营养、中心静脉置管等,均会增加胰腺癌患者静脉血栓形成的风险。这些治疗所致的局部组织损伤、肿瘤细胞坏死、血管内皮细胞损伤启动促凝机制、炎症因子释放、促凝物质释放、血液动力学改变均可以导致高凝状态[43]。手术后患者高凝状态从术前的40%提高至术后1周的86%,术后至少持续1个月,这可能与术后的患者卧位多、活动少有关[44]。某些分子靶向治疗的药物,如贝伐单抗,可通过使血管内皮下的促凝血磷脂暴露,减少氧化亚氮和前列环素的产生,促使血小板聚集,介导产生促红细胞生成素,增加红细胞压积和血液黏稠度等增加血栓风险[45]。5-氟尿嘧啶及吉西他滨等化疗药物能诱导活化单核细胞及肿瘤细胞表面的TF,下调纤溶水平,导致蛋白C系统缺乏,抗凝血酶减少,有助于高凝状态形成[46]。

胰腺癌患者血栓形成的防治措施由于胰腺恶性肿瘤并发DVT可能发病的因素多而复杂,一旦DVT脱落发生肺栓塞将有生命危险,因此,患者在诊断为胰腺癌时,我们在作出治疗计划同时也应该考虑患者存在高凝状态及DVT形成的可能。完善各项检查包括凝血功能相关指标,同时,应该给患者行深静脉的彩色超声检查以排除DVT。不管存在DVT与否,如果患者存在高凝状态,应该在治疗过程中结合一定的抗凝措施。

抗凝药物的应用 低分子肝素的作用是增强抗凝血酶-Ⅲ与凝血酶的亲和力,加速凝血酶的失活,抑制血小板的黏附聚集,刺激血管内皮细胞释放抗凝物质和纤溶物质。抑制血小板,增加血管壁的通透性[47]。有研究表明,低分子肝素可以抑制肿瘤细胞起源的内皮细胞,抑制其细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)传导途径下游的磷酸化,从而干扰肿瘤细胞的增殖[48]。低分子肝素主要通过TF途径抑制剂,下调从内皮细胞释放TF,从而抑制VEGF的释放,抑制内皮细胞增殖,从而控制高凝状态[49]。除了降低死亡率和发病率相关的静脉血栓栓塞,实验和临床数据表明,低分子肝素可以通过直接影响肿瘤生物学行为来改善癌症患者的总体生存率。低分子肝素目前被认为是癌症患者最主要的治疗和预防静脉血栓栓塞的方法[50]。但是对于低分子肝素是否能直接延长肿瘤患者的生存期,目前还存在争议[51]。需要更多的进一步的随机对照试验,以及同类癌症患者群体,来验证低分子肝素标准治疗和预防方案。

阿司匹林是应用最广泛的非甾体类抗炎镇痛药物,其抗凝作用是通过抑制血小板的前列腺素环氧酶、从而防止血栓烷A2(thromboxane A2,TXA2)的生成而起作用(TXA2可促使血小板聚集),这一作用是不可逆的。小剂量口服阿司匹林可以达到预防血栓形成的作用。另外,有大量的研究表明阿司匹林有一定的抗肿瘤作用[52-53],其抗肿瘤作用机制主要通过抑制环氧化酶(cyclooxygenase,COX)和通过不依赖PGs途径即抑制激活蛋白(activatorprotein1,AP-1)活性、降低细胞周期素依赖蛋白激酶的表达来诱导细胞凋亡,提高谷胱甘肽-S-转移酶-θ(glutathione S-transferase theta,GST-θ)活性等来发挥抗肿瘤作用。当然,阿司匹林的抗炎和镇痛作用可以提高癌症患者的生存质量,间接提高了患者的机体免疫力。值得注意的是,Rothwell等[54]的分析显示规则性服用阿司匹林使胰腺癌的死亡率显著减少。Weilbaecher等[55]报告,由于阿司匹林引起的血小板失活可能有助于减缓和防止肿瘤细胞的扩散。由于阿司匹林可以降低远处转移的风险和胰腺癌死亡率,我们也可以合理推断出阿司匹林在胰腺癌方面的治疗潜力。近期一项Meta分析也提出阿司匹林可能降低胰腺癌的发生率[56]。

华法林为间接作用的香豆素类口服抗凝药,通过抑制维生素K在肝脏细胞内合成凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ,从而发挥抗凝作用。华法林通过抑制凝血因子的活化从而抑制新的血栓形成,限制血栓的扩大和延展,抑制在血栓的基础上形成新的血栓,有利于机体纤溶系统清除已经形成的血栓。所以华法林没有直接溶栓的作用,使用华法林后血栓减小甚至消失是华法林在抑制新的血栓形成的同时,机体清除血栓的机制(纤溶)作用的结果。目前在预防血栓形成和DVT患者中,约有50%以上口服华法林[57]。最近一项研究还显示华法林可以通过抑制维生素K依赖性的gas6蛋白的分泌,抑制其与Axl基因的结合,从而抑制胰腺癌细胞的增殖、侵袭和转移[58]。

氯吡格雷是一种血小板聚集抑制剂,在体内通过氧化作用形成2-氧基-氯吡格雷,然后再经过水解形成活性代谢物(一种硫醇衍生物)。这种活性代谢物选择性抑制二磷酸腺苷(ADP)与它的血小板受体结合,继发引起ADP介导的糖蛋白GPⅢb/Ⅲa复合物的活化,此可抑制血小板聚集,氯吡格雷必须经生物转化才能抑制血小板的聚集。暴露于氯吡格雷的血小板寿命受到影响。而血小板正常功能的恢复速率同血小板的更新有关。与阿匹林相比,氯吡格雷可显著降低新的缺血性事件(包括心肌梗死,缺血性中风和其他血管疾病死亡)的发生率[59]。另外,最近有研究者发现,抗血小板的药物氯吡格雷可以有效地治疗肿瘤相关的血栓形成,减少了原位胰腺癌小鼠模型肿瘤的进展[60]。因此,有高凝状态的胰腺癌患者可以通过口服氯吡格雷减少胰腺癌的血栓事件,并有望减少其转移。

目前还有以血小板整合素αⅡbβ3为靶点的药物阿西单抗、依替巴肽和替罗非班等,这些药物均在一定程度上影响血小板聚集功能,抑制血小板与肿瘤细胞的结合,进而降低肿瘤细胞的转移[61]。

下腔静脉滤器的置放 对于存在静脉血栓和肺栓塞的恶性肿瘤患者在抗凝同时是否要置放下腔静脉滤器目前还存在争议,一项前瞻性随机对照临床研究结果显示置放下腔静脉滤器、达肝素钠联合与单纯使用达肝素钠抗凝治疗相比在安全性、生存期以及肺栓塞复发、DVT复发方面没有明显的优势[62]。

抗TF的靶向药 由于目前发现胰腺癌高凝状态和血栓形成最主要的原因与TF有关,因此研究抗TF的药物也可能对胰腺癌患者的高凝状态及对胰腺癌的发展和转移有一定的抑制作用。Saito等[63]研制出一种抗TF单克隆抗体,能使胰腺癌细胞的侵袭能力和MMP-9的表达明显下降,从而抑制了胰腺癌细胞的转移和耐药的形成。他们还用TF单克隆抗体结合甲基他汀 E (monomethyl auristatin E,MMAE) 制成药物传送系统,以便能更好地在体内发挥作用[64]。虽在体外或动物模型中对于靶向TF的药物研究取得了一些进展,但是能否应用于临床还需长期研究。

结语胰腺癌的高凝状态也是多种肿瘤的共同问题,其所造成的血栓形成是肿瘤患者的致死原因之一。胰腺癌的高凝状态的病理生理机制非常复杂,某些是独立因素,也有是体内各种因素相互作用引起,需要我们完善患者各项检查,综合考虑其形成原因并作出相应的防治措施。也许能够另辟蹊径,从控制胰腺癌的高凝状态入手,如合理运用抗凝药物,减少患者的血栓事件,进而提高肿瘤患者的生存期,甚至能够通过研究高凝状态的深层次的分子机制,找到抑制肿瘤生长、侵袭和转移的方法,使胰腺癌的治疗更进一步。

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