角质细胞生长因子-2对右旋葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠结肠炎和肠道黏膜屏障的保护作用

(1复旦大学附属中山医院消化科, 2呼吸科 上海 200032)

炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)是一种病因不明的肠道慢性非特异性炎症性疾病,主要包括克罗恩病(Crohn’s disease,CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)。IBD病程漫长,常反复发作,缺乏长期有效的根治措施。尽管IBD的病因尚未完全明确,但研究表明肠道黏膜屏障功能障碍在IBD发病中起重要作用[1]。肠道黏膜是一道重要的机械屏障,阻止有害物质和有害微生物进入肠道组织并激活免疫反应[2]。而肠道黏膜屏障功能障碍和肠道炎症互为因果,肠道炎症可引起肠道屏障功能障碍,因此IBD患者往往肠道渗透性增加,而肠道黏膜屏障功能障碍也可能是IBD病情发作和复发的主要因素[3]。因此,修复肠道黏膜功能是IBD治疗的重要目标之一。角质细胞生长因子-2(keratinocyte growth factor 2,KGF-2)问世以来已被用于许多上皮损伤疾病的临床研究,如静脉溃疡、角膜擦伤、急性肺损伤等[4]。我们推测,KGF-2能够促进上皮细胞增殖从而保护肠道屏障,有望成为IBD的潜在治疗药物。

KGF家族是成纤维生长因子家族 (fibroblast growth factors,FGFs)的亚族,其主要功能是作为旁分泌因子调控上皮细胞增殖、分化、迁移,与上皮组织的生长和修复密切相关。KGF-2是该家族的成员,主要由基质细胞表达和分泌,又称为FGF-10。KGF-2释放后与上皮组织中特异性表达的受体FGFR2b和FGFR1b结合,主要作为旁分泌因子促进上皮细胞增殖分化、生成血管和维持毛细血管的分子屏障功能[5]。既往研究证实KGF-2对DSS诱导的小鼠结肠炎的保护作用。Miceli等[6]的研究结果显示KGF-2可以降低体重减轻、粪便评分和病理评分,其作用具有剂量依赖性,腹腔注射用药最小起效浓度为1～3 mg/kg。Greenwood-Van等[7]的研究则显示5 mg/kg腹腔注射的KGF-2可以重建和修复被炎症破坏的电子转运。KGF-2对DSS诱导的小鼠结肠炎肠道黏膜屏障的保护作用及其机制尚待进一步研究。

本研究的目的是:(1)证实KGF-2对DSS诱导的小鼠结肠炎具有减轻炎症和保护肠道黏膜屏障的作用;(2)探究KGF-2对肠道组织中紧密连接蛋白的保护作用;(3)探讨KGF-2对DSS诱导的小鼠结肠炎肠道组织中炎症相关细胞因子TNF-α、IL-6、IL-10、TGF-β1、IL-1β、IFN-γ的作用。从而证实KGF-2的临床应用价值,为临床IBD的研究和疾病的预防和治疗提供新思路。

材 料 和 方 法

试剂KGF-2试剂由上海新生源医药集团有限公司提供,溶于PBS缓冲液配成注射溶液。DSS购于美国MP Biomedicals公司,加双蒸水配置为3.5%溶液。FITC-D购于美国Sigma公司,使用前用双蒸水配置成3.5%溶液。小鼠TNF-α、IFN-γ ELISA试剂盒购于美国BioLegend公司,IL-6、IL-10、TGF-β1、IL-1β ELISA试剂盒购于美国eBioscience公司,ZO-1抗体购于美国Santa Cruz公司,occludin抗体购于美国Invitrogen公司,其余试剂为国产分析纯。

实验动物SPF级雄性C57BL/c小鼠36只,体重(22±3)g,购于上海万样医用实验动物饲养厂。实验前饲养6天,按随机数字表法分为4组。

实验造模和特异性给药36只小鼠均分4组:正常对照组(Control)、DSS模型组(Model)、中剂量KGF-2组[Model+KGF-2(5 mg/kg)]、高剂量KGF-2组[Model+KGF-2 (10 mg/kg)]。正常对照组饮用自来水,其余饮用双蒸水配置的3.5%DSS溶液,DSS溶液3天更换1次。KGF-2给药与造模同时进行,给药形式为腹腔注射,正常对照组和DSS模型组注射等量PBS溶剂。

动物行为学检测实验过程中观察小鼠一般情况,如进食、饮水和活动情况等,从第1天开始每天记录小鼠的体重、粪便隐血或出血情况、粪便性状,并进行疾病活动指数(disease activity index,DAI)评分[8](表1)。造模成功的标准为实验过程中小鼠DAI较0天时的DAI上升,即观察到体重减轻、粪便隐血或便血、粪便形状改变等结肠炎临床表现。

处死取材第7天时,每组各取3只小鼠予以FITC-D灌胃,4 h后心脏取血,离心取血清,用多功能酶标仪检测FITC-D浓度。每组其余6只小鼠处死,量取结肠长度,取结肠组织留备HE染色和免疫组化染色、匀浆ELISA检测和Western blot检测。HE染色标本根据Cooper HS标准[8](表2)进行病理组织学评分。

表1 DAI 评分标准Tab 1 Standard of DAI

表2 病理评分标准Tab 2 Standard of histological evaluation

Final score=(I+E+C)×P.

免疫组化染色运用免疫组化法检测各组小鼠结肠组织中ZO-1和occludin蛋白的表达。将组织块用石蜡包埋、切片,经过烤片、脱蜡、暴露抗原位点、灭活过氧化物酶、血清封闭后,加对应的抗体孵育并显色。使用Image Pro Plus v6.0软件定量。

Westernblot检测运用Western blot方法检测各组小鼠结肠组织中ZO-1和occludin蛋白的表达。将结肠组织细胞裂解,提取组织蛋白、定量和分离,转膜后分别与对应抗体孵育并显色。使用Image Pro Plus V6.0软件定量。

ELISA检测运用ELISA方法检测小鼠组织匀浆中TNF-α、IL-6、IL-10、TGF-1β、IL-1β、IFN-γ的表达,分别按照各ELISA试剂盒说明书进行检测。

统计学处理所测数据用SPSS 22.0进行One-way ANOVA方法检验,P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

体重变化与DAI第4天,DSS模型组小鼠体重开始出现明显下降、血便、活动度降低。第7天结肠病理组织活检可见肠壁被炎性细胞浸润,肠壁坏死较严重,黏膜糜烂,大量腺体脱落,杯状细胞破坏。

DSS模型组的体重变化的百分比与正常对照组(P=0.013 2)、中剂量KGF-2组(P=0.013 3)和高剂量KGF-2组(P=0.017 6)之间的差异均有统计学意义。KGF-2组的体重下降程度明显减弱(图1A)。饮用DSS溶液后,DSS模型组、中剂量KGF-2组、高剂量KGF-2组的DAI均较0天时有不同程度的上升,以DSS模型组最为明显(图1B)。DSS模型组的DAI与正常对照组(P=0.004 8)、中剂量KGF-2组(P=0.017 2)和高剂量KGF-2组(P=0.021 1)相比差异均有统计学意义(图1B)。

结肠长度正常对照组、DSS模型组、中剂量KGF-2组及高剂量KGF-2的结肠长度分别为(6.922±0.117 6)cm、(4.956±0.258 3)cm、(5.750±0.125 8)cm和(6.289±0.215 7)cm。与正常对照组相比,DSS模型组的结肠长度缩短明显(P<0.000 1);与DSS模型组相比,中剂量KGF-2组(P=0.010 9)和高剂量KGF-2组(P=0.001 1)的结肠长度均明显增加(图1C)。

图1KGF-2对DSS诱导的小鼠结肠炎的治疗作用
Fig1EffectofKGF-2onDSS-inducedmurinecolitis

病理改变与正常对照组相比,DSS模型组结肠病理标本镜下可见大量炎症细胞浸润,病变穿透黏膜全层,隐窝大面积破坏,表面上皮消失。2个KGF-2组与DSS模型组相比,炎症浸润程度相对减轻,隐窝结构相对完整,病变深度局限,病变范围较小(图2)。根据Cooper HS标准[8]对4组分别进行组织学评分,与正常对照组(2.500±0.223 6)比较,DSS模型组(20.00±1.844)的病理组织评分显著升高(P<0.000 1);而与DSS模型组比较,中剂量组(12.33±1.202,P=0.005 9)和高剂量组(9.333±1.476,P=0.0011)病理评分均显著下降(图1D)。

Colonic HE staining in Controls (A),Model (B),Model+KGF-2 (5 mg/kg) (C) and Model+KGF-2 (10 mg/kg) (D).No inflammation infiltrate was appreciated.The crypts were straight with the base of the crypt sitting on the muscular mucosa in A.There was shortening of the crypts and focal thinning of the epithelium.The lamina propria and submucosa showed an inflammatory infiltrate in B.In C and D,the inflammatory infiltration and structure damage was slighter than in B.

图2小鼠结肠组织HE染色(100×)
Fig2ColonicHEstainingofrats(100×)

FITC-D渗透率4组的FTIC-D渗透率(×10-4):正常对照组为12.80±1.367,DSS模型组为168.50±27.01,中剂量KGF-2组为48.04±23.21、高剂量KGF-2组为14.62±1.812。DSS模型组的渗透率最高,且与正常对照组(P=0.045)、中剂量KGF-2组(P=0.0277)、高剂量KGF-2组(P=0.0047) 的差异均有统计学意义。与DSS模型组相比,2个KGF组的FITC-D渗透率明显下降(图3)。

免疫组化正常对照组ZO-1和occludin主要位于上皮细胞的边缘,细胞膜顶端,沿绒毛下方均匀连续分布;DSS模型组ZO-1和occludin蛋白分布不均、散乱、稀疏,染色变淡,线条模糊;KGF-2组ZO-1和occludin在结肠黏膜的上皮层中分布均匀,线条清晰(图4)。采用Image Pro Plus 6.0以平均阳性光密度值(IOD/area)计算蛋白表达强度后,显示DSS模型组结肠黏膜ZO-1(P=0.000 2)和occludin(P< 0.0001)蛋白表达较正常对照组显著减少,中剂量KGF-2干预后,ZO-1表达较模型组增加(P=0.013 3),而occludin表达并无显著提高;高剂量KGF-2干预后,ZO-1(P=0.003 3)和occludin(P=0.000 7)阳性表达较模型组显著增加(图5)。

图3KGF-2对肠道FITC-D渗透率的影响
Fig3EffectofKGF-2onFITC-Dpermeability

Westernblot检测用于测试紧密连接(tight junction,TJ)蛋白ZO-1和occludin在结肠组织中的表达。TJ蛋白在正常对照组的表达最高,在DSS模型组中显著下降,KGF-2组TJ蛋白表达情况介于两者之间(图6)。采用Image Pro Plus 6.0计算灰度值后,显示DSS模型组结肠黏膜ZO-1和occludin蛋白表达均较正常对照组显著减少(ZO-1:P<0.000 1;occludin:P=0.007),高剂量KGF-2干预后,ZO-1和occludin阳性表达较模型组显著增加(ZO-1:P<0.000 1;occludin:P=0.043 4),中剂量KGF-2干预后,ZO-1阳性表达较DSS模型组增加(P=0.001 7,图5～6)。

ELISA检测检测结肠组织匀浆中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-10、IFN-γ、TGF-β1、IL-1β的水平,其中高剂量KGF-2组TNF-α(P<0.000 1)、IL-6(P=0.007 7) 和 IL-10 (P=0.002 4)的水平与模型组差异有统计学意义,而IL-1β、TGF-1β、IFN-γ各组间均差异无统计学意义(图7)。

Colonic immunohistochemical staining on ZO-1 and occludin in Control (A),Model(B),Model+KGF-2 (5 mg/kg) (C) and Model+KGF-2 (10 mg/kg) (D).A lot of brown particles can be seen on glandular epithelium and intestinal epithelium in A.Only scattered brown granules were seen on glandular epithelium and intestinal epithelium in B,and the staining was the lightest.In C and D,more brown granules were seen on glandular epithelium and intestinal epithelium.

图4ZO-1和occludin免疫组化染色(400×)
Fig4ColonicimmunohistochemicalstainingofZO-1andoccludin(400×)

图5ZO-1和occludin免疫组化染色与Westernblot表达
Fig5ImmunohistochemistystainingandWesternblotofZO-1andoccludinexpression

图6ZO-1和occludin的Westernblot表达
Fig6WesternblotphotographsofZO-1andoccludin

讨 论

大量研究表明,肠道黏膜屏障功能障碍是IBD发病的重要机制之一。KGF-2能够促进小肠上皮细胞增殖分化,修复黏膜屏障,被认为是能够改善IBD临床症状的潜在药物。

本实验中,给予3.5%DSS 7天后,DSS模型组各动物均出现不同程度的腹泻、便血、体重下降、结肠缩短,光镜下表现也符合结肠炎症的病理学改变。DSS模型组和KGF-2组的小鼠饮用DSS溶液后,DAI评分均较0天时升高,证明实验造模成功。腹腔注射KGF-2之后,实验小鼠的腹泻、便血、结肠缩短、体重下降等现象均有不同程度的减轻,DAI评分显著下降,组织学检查可见炎症程度减轻、浸润深度缩短、隐窝结构修复、病变范围减少,高剂量KGF-2 (10 mg/kg)的保护效果比中剂量KGF-2 (5 mg/kg)更为显著。结果证明,5 mg/kg和10 mg/kg剂量的KGF-2可以预防DSS诱导的小鼠结肠炎,这与Greenwood-Van等[7]和Meceli等[6]的研究成果一致。但在预实验中,3 mg/kg剂量的KGF-2对小鼠结肠炎并无明显的保护作用(数据未显示在本文中),这与Miceli等[6]研究结果显示的KGF-2最小起效浓度在1～3 mg/kg并不相符,可能由于小鼠对药物敏感性的个体差异和饲养环境不同引起。在后续的机制研究中,我们也发现KGF-2的一些保护效应,如保护occludin表达水平、抑制TNF-α分泌、刺激IL-6分泌,需要10 mg/kg剂量才能被观察到,由此可见KGF-2的预防作用具有剂量依赖性。

图7KGF-2对细胞结肠组织细胞因子表达的作用
Fig7EffectofKGF-2oncytokinesincolontissue

FITC-D常作为提示肠道通透性的指示剂,而肠道通透性直接反映了肠道屏障的功能。本实验各组之间FITC-D渗透率的差异表明,KGF-2可以减轻DSS引起的肠道通透性增高,修复受损的肠道黏膜。肠道通透性受到紧密连接蛋白复合物的调节[9],Occludin和ZO-1是紧密连接复合物中重要的结构蛋白。IBD患者的肠道病理组织中ZO-1和occludin表达降低[10]。为了深入探讨KGF-2保护肠道黏膜屏障的机制,我们检测了ZO-1和occludin在实验小鼠肠道黏膜的表达情况,发现与正常对照组相比,KGF-2可以减轻DSS诱导的结肠炎引起的ZO-1和occludin表达下降,提示KGF-2可能参与调控ZO-1和occludin的表达。

既往研究表明,KGF-2的生物学效应是通过激活特异性受体FGFR来实现,KGF-2与特异性表达于上皮细胞表面的FGFR2b结合,形成FGF10-FGFR2b二聚体,使FGFR胞内段的酪氨酸激酶结构域磷酸化,激活胞内底物FRS2α和PLCγ1,FRS2α通过RAS-MAPK或PI3K-AKT信号通路调控生物学活动,PLCγ1激活蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)而发挥生物学效应[11]。PKC的激活可刺激ZO-1和occludin的转录,增加ZO-1和occludin的表达[12]。因此,我们推测KGF-2通过激活FRS2α和PLCγ1来激活PKC,提高ZO-1和occludin的表达水平,从而修复受损的肠道黏膜屏障。

我们检测了各组小鼠肠道组织匀浆中的多种细胞因子以探究KGF-2对其影响。IBD疾病活动期肠道内的多个细胞因子分泌失衡,包括TNF-α、IL-6、IL-10、IL-1β和TGF-β1等[13]。我们使用ELISA检测结肠组织匀浆中的促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ和抑炎因子 IL-10、TGF-β1,发现KGF-2可抑制TNF-α的产生,增加 IL-6和 IL-10的分泌。10 mg/kg KGF-2将结肠组织的TNF-α降到了与正常对照组相当的水平,同时刺激了IL-10和IL-6的分泌,经过10 mg/kg KGF-2给药的小鼠结肠组织的IL-10和IL-6水平高于正常对照组。TNF-α能通过多种途径促进炎症,可直接损害上皮组织和紧密连接蛋白[14]。抗TNF-α治疗可减轻炎症并显著抑制DSS诱导结肠炎引起的肠道通透性增加。IL-6是一个可由多种细胞分泌、具有多重生物学效应的细胞因子,IBD患者体内IL-6显著提高。IL-6虽然是促炎因子,却能促进肠道上皮细胞的增殖和分化,在IBD引起的溃疡中,IL-6有利于黏膜愈合[13]。既往研究已经充分证实IL-10具有加强黏膜屏障功能[15],IL-10的表达水平与黏膜屏障信号标记分子的变化一致。因此,KGF-2也可能是通过抑制TNF-a的产生来减少对上皮和紧密连接蛋白的损害,保护肠道黏膜,从而缓解结肠炎症。增加黏膜IL-6和IL-10的生成,促进上皮的增殖分化,加强黏膜屏障功能,可改善结肠炎症。

综上所述,KGF-2保护肠道黏膜屏障功能主要通过抑制TNF-α及促进IL-6和IL-10分泌来实现。此外,IFN-γ和IL-1β也是IBD相关的重要促炎因子[13]。TGF-β1可以抑制黏膜巨噬细胞和效应T细胞产生的促炎效应[16]。但本实验未发现DSS与KGF-2对这3个因子产生明显影响,DSS仅造成轻微的IL-6、IFN-γ 和 IL-1β升高,但差异无统计学意义,可能是样本数量不足或实验小鼠个体差异引起。而KGF-2未对IFN-γ 、IL-1β、TGFβ1产生效果,表明保护效应可能并非直接通过这3个细胞因子实现。

本研究证实,KGF-2可减轻DSS诱导的小鼠结肠炎,保护肠道屏障功能,其机制可能是通过增强肠道上皮紧密连接蛋白ZO-1和occludin的表达,同时抑制黏膜TNF-α及促进IL-6和IL-10分泌而发挥作用。KGF-2可能成为IBD治疗和预防复发的重要补充药物。

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