24味中草药对舌鳎源嗜水气单胞菌的体外抑菌效果

2018-03-22王洪彬李永慧朱利霞吴同垒张志强高桂生史秋梅

水产学杂志 2018年1期

王洪彬，李永慧，朱利霞，吴同垒，张志强，高桂生，史秋梅

（1.河北科技师范学院动物科技学院，河北省预防兽医学重点实验室，河北秦皇岛 066604；2.秦皇岛第二医院，河北秦皇岛 066604）

舌鳎Cynoglossus sp.营养丰富，肉质细腻、味道鲜美，广受消费者喜爱，是名贵的海水养殖鱼类之一。随着海水养殖舌鳎规模的扩大，各种细菌性疾病也随之而来，其中由嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila引起的细菌病最为严重。嗜水气单胞菌是一种常见的条件致病菌[1,2]，能够引起多种淡水鱼、蛙、哺乳动物以及海水养殖鱼类的败血症、皮肤溃疡、腹泻等疾病[3]。有资料显示，该菌还是一种严重的“人-畜-鱼”共患菌[4]，研究该菌具有重要的公共卫生学意义。

近年来，由于鱼类养殖中大量使用、滥用抗生素和化学药物，导致水体养殖环境恶化，也产生了耐药性菌株，水产养殖鱼类免疫力下降，抗病能力减弱，甚至严重威胁人类的健康和食品安全。中草药取材方便、价格低廉，含多种生物活性物质，如有机酸类、生物碱类等，可调节水产养殖鱼类的免疫力，能够增强鱼类的抗菌、抗病能力等[5]，越来越被人们所接受。从中草药中筛选出具有更强抗菌能力的药物受到了极大的重视[6]。本试验选取板蓝根、连翘、诃子等24味中草药，采用水提法提取中药材有效成分，测定这24味中草药水提物对舌鳎源嗜水气单胞菌的抑菌效果，为进一步筛选出具有明显抑菌作用的中草药和临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验菌株：舌鳎源嗜水气单胞菌为本实验室提供，编号为A.H QHD-1。

24种中草药是：诃子、苏木、艾叶、石榴皮、厚朴、蒲公英、马齿苋、知母、决明子、桔梗、龙胆草、青皮、苦参、郁金香、香附、防风、荆芥、黄柏、连翘、黄芩、夏枯草、紫花地丁、板蓝根和女贞子，购自秦皇岛民乐医药。营养琼脂、营养肉汤培养基购自青岛高科园海博生物技术有限公司。

试验仪器有：G1040WS-立式自动压力蒸汽灭菌器，致微（厦门）仪器有限公司；无菌工作台，北京亚泰科隆仪器技术有限公司；冰箱，青岛海尔特种电冰箱有限公司；隔水式恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；常规试剂与仪器均等由本实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 试验菌株菌液的制备

从-80℃冰箱中取出舌鳎源嗜水气单胞菌，接种于普通的营养琼脂培养基上，28℃培养过夜。无菌挑取嗜水气单胞菌单个菌落，接种于含有4mL营养肉汤的试管培养基中，置于28℃180r/min摇床，摇菌12h。用平板菌落计数法确定菌液浓度，使菌液最终稀释至1×108cfu/mL。

1.2.2 单味中草药药液制备

根据参考文献[7]中报道的水提法，并略加改动，提取连翘、知母、诃子等24味中草药有效成分。先称取定量的中草药原料，除去杂质，清洗，干燥。粉碎后，每种中草药称取40g倒入烧杯中，加入400mL水浸泡1h。然后煎煮，边煮边搅拌，连煮2次，冷却并过滤，离心后浓缩至40mL，使药液终浓度为1g/mL，分装后121℃灭菌10min，分装并置于4℃冰箱中保存备用。

表1 中草药对嗜水气单胞菌的体外抑菌效果Tab.1 The in vitro bacteriostatic effects of Chinese herbal medicines on Aeromonas hydrophila

1.2.3 中草药体外抑菌圈直径的测定

[8]中的琼脂平板打孔法测定。抑菌圈直径≥20mm为极敏，20mm＞抑菌直径≥15mm为高敏，15mm＞抑菌圈直径≥10mm为中敏，10mm以下为低敏[9]。

1.2.4 中草药最小抑菌浓度（MIC）的测定

按参考文献[10]略加改动，用试管二倍稀释法测定MIC。先将11只试管标号1～11，每管加入2mL 2×的营养肉汤；在第2个管中加入2mL的药液（1g/mL），混合均匀后吸取2mL到第3管里，依次重复直到第9管，从第9管吸取2mL到第11管混合均匀后弃去2mL，第10管不加药作为阳性对照；第1～10管各加入10μL菌液（菌液浓度1×108cfu/mL），第11管不接菌为阴性对照。每种药物3个重复，28℃培养24h。利用平板分区划线法，无菌棉签蘸取不同稀释度的培养液涂板，28℃培养12h后观察结果。无菌生长时的药物浓度为该药的MIC。

表2 不同中草药对嗜水气单胞菌的MICTab.2 The minimum inhibitory concentration （MIC）of different Chinese herbal medicines on Aeromonas hydrophila

2 结果与分析

由表1可知：舌鳎源嗜水气单胞菌对诃子、苏木、夏枯草、青皮这4种中草药极敏感；对黄芩、板蓝根、厚朴、紫花地丁高度敏感；对女贞子、苦参、荆芥中度敏感；对黄柏、龙胆草、知母、防风、决明子、郁金香、马齿苋、艾叶、石榴皮、桔梗低敏感。建议在水产养殖中联合使用诃子和青皮，以达到更好的治疗效果。

由表2可知：诃子和夏枯草对舌鳎源嗜水气单胞菌的MIC为31.25mg/mL,；苏木、青皮对该菌的MIC为62.5 mg/mL；紫花地丁、厚朴对该菌的MIC为125 mg/mL；黄芩、板蓝根、女贞子、蒲公英对该菌的MIC为250 mg/mL；香附、苦参、荆芥对该菌的MIC为500 mg/mL；黄柏、龙胆草等中草药没有抑菌效果。每味中草药对舌鳎嗜水气单胞菌的MIC不同，生产中可以据此合理调整，减少药物的滥用和浪费，提高经济效益。

3 讨论

近年来，嗜水气单胞菌等造成的海水养殖细菌病逐年增加，大都采用抗生素治疗这些细菌性疾病[11]。抗生素防控了病原菌感染，也导致了耐药菌株的出现[12]。1957年美国首次观察到耐磺胺药物杀鲑气单胞菌Aeromonas salmonicida，该菌引起了虹鳟的大规模感染、死亡；1971年在日本大麻哈鱼Oncorhynchus keta体内检测到耐磺胺药物和氯霉素的杀鲑气单胞菌；20世纪80年代末，多重耐药性嗜水气单胞菌的出现导致淡水鱼患严重的细菌性败血症在全国范围内流行，都表明了多种致病菌产生了单一或者多重耐药性[13]。此外，抗生素在水产品中高残留，导致接触人体耐药菌增加，耐药性逐渐增强。总之，抗生素以及化学药物的滥用、误用等造成了海水养殖环境的恶化；大量致病性耐药菌株的出现，使水产养殖业遭受巨大经济损失；食品中抗生素高残留，极大威胁了人类的健康。

中草药具有特殊的抗病原微生物机制，治疗细菌性疾病效果较好[14]。研究表明，中草药主要通过调动机体内的积极因素来减弱细菌对组织的破坏以及降低细菌毒力等方式来发挥抑菌作用[14]。如猪苓、黄芪等中草药可以提高外周血淋巴细胞的转化率、增加鸡淋巴细胞花环的形成等。然而，部分中草药的抗菌机制主要通过对菌体直接发挥作用而达到抑菌和杀菌作用，如大蒜分子中含有的氧原子可与半胱氨酸分子中细菌生长繁殖所必需的巯基结合，使巯基变成了非活性物质，极大抑制了细菌的生长繁殖。

相关文献显示，中草药防治嗜水气单胞菌性细菌病比抗生素具有明显的独特优势[15]。中草药是中国医学瑰宝，是提高防病治病水平、增加经济效益以及发展绿色水产养殖业和人类健康的需要[5,16]；中草药具有抗菌、抗病作用，如黄芩、黄柏等能够抗菌、调节机体自身免疫，增强免疫力等[17,18]；中草药无药残、抗药性不显著、来源广泛、无公害等，应用中草药防治鱼病越来越引起科研工作者的关注[16]。黄岑、诃子具有广泛的抑菌谱，应用广泛。这两种中草药对大肠杆菌Escherichia coli、绿脓杆菌Pseudomonas aeruginosa均有一定的抑菌作用[19]，本试验也显示嗜水气单胞菌对这两种中药极为敏感，其中诃子对嗜水气单胞菌的抑菌作用最强，这与陶健等[15]、罗新等[20]的研究结果一致。诃子内含有糖类、多种氧化酶等，具有广泛的药理作用。厚朴多用于临床治疗细菌性疾病、炎症等，在传统医学、日本汉方医学已经得到广泛的应用[20]。嗜水气气胞菌对连翘表现耐药，这与陈晓利等[10]试验结果不同，其主要原因可能在于菌株分离、来源地、基因以及中草药煎煮方法等不同。本研究选取“人-畜-鱼”共患-嗜水气单胞菌，进行体外抑菌试验，旨在筛选出对嗜水气单胞菌有较强抑制作用的中草药，为中草药临床治疗由嗜水气单胞菌引起的细菌病提供了重要理论参考。中草药成分复杂，有效成分和抗菌机制、作用机理有待进一步研究。

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参考文献

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［3］卢静,王振宁,陈锐,等.几种中药单体和抗生素对嗜水气单胞菌及温和气单胞菌的体外抑菌活性研究［J］.水生生物学报,2013,37（6）:1128-1132.

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［5］胡金城,刘金兰,吕爱军,等.中草药在水产养殖中的应用［J］.天津水产,2016（1）:15-22.

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