南美白对虾贮藏期间Ca2＋-ATPase活力变化规律与机制

2018-03-20石启龙曹淑敏

食品科学 2018年5期

赵亚，石启龙*，曹淑敏

（1.山东理工大学农业工程与食品科学学院，山东淄博 255000；2.山东理工大学实验管理中心，山东淄博 255000）

食品保藏的目的是最大限度地保持其质量特性，因此了解影响食品稳定性的因素及控制反应速率的措施对于评估食品贮藏稳定性至关重要。近年来，水分活度（water activity，aw）作为评估食品安全贮藏标准的局限性越来越受到学者们的重视，因此玻璃化转变理论被提出[1]。玻璃化转变是指非晶态聚合物由玻璃态到橡胶态或橡胶态到玻璃态的转变，其特征温度称为玻璃化转变温度（glass transition temperature，Tg）[2]。根据玻璃化转变理论，当体系温度低于Tg时，食品处于玻璃化状态，体系黏度较高，各种受分子扩散运动控制的反应速率减慢，其稳定性最强；反之，当贮藏温度高于Tg时，体系处于橡胶态，分子流动性加强，受分子扩散运动控制的各种化学反应速率加快[2-3]。Agustini等[4]研究表明，当金枪鱼肉在温度低于Tg的条件下贮藏时，鱼肉的生物活性反应（如酶促反应、三磷酸腺苷降解）受到抑制，鱼肉贮藏期延长。虹鳟鱼肉（Tg＝-13 ℃）在-9 ℃条件下贮藏6 个月，总挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量与硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARS）值较高，鱼肉劣变速度加快；而在Tg及以下温度（-18 ℃）贮藏时，TVB-N含量与TBARS值则无明显变化[5-6]。

南美白对虾营养丰富且具有一定的保健功能，但是其水分含量高，内源蛋白酶活性较强，导致其品质下降较快[7-8]。冷冻和冷藏是虾肉保藏常用方法，但虾肉在冷冻及贮藏过程中会出现冰结晶成长、重结晶、蛋白质变性等劣变反应，导致其凝胶能力下降和持水力降低[9-11]。因此，蛋白质冷冻变性是水产品加工与质量控制领域的研究重点和热点。

目前，国内外对于水产品冷冻变性研究主要集中在生化特性变化[12-13]、抗冻剂筛选[14-16]等方面，但是蛋白质冷冻变性的机制尚未明确。石启龙等[17]探讨了添加糖类对南美白对虾肉热力学转变与状态图的影响，发现添加菊糖、海藻糖、麦芽糊精等糖类能显著提高虾肉最大冷冻浓缩溶液时的玻璃化转变温度T’g。此外，Shi Qilong等[18]还指出，为探讨虾肉贮藏品质变化机制，需要系统研究不同状态水分（例如单分子层水分、非冻结水与冻结水分）含量的虾肉在不同贮藏温度（例如T＜Tg、Tg＜T＜冻结后虾肉的温度、T＞Tg）条件下的品质变化规律。肌原纤维蛋白是水产品最主要的结构与功能性蛋白质，其中肌球蛋白占肌原纤维蛋白的55%～60%[19]。肌球蛋白头部在冷冻和解冻过程中非常敏感，其分子构象易发生改变，进而导致Ca2+-ATPase活力降低；冷冻和冻藏过程中蛋白质间相互作用重排形成新的分子也是导致ATPase活性降低的原因。因此，Ca2+-ATPase活力被用于评估肌原纤维蛋白质冷冻和冻藏过程中变性程度的指标[20]。本实验将3 种不同水分含量的虾肉贮藏于4 种不同温度的环境中，研究了贮藏期间其Ca2+-ATPase活力变化规律，揭示水分含量、Tg与虾肉Ca2+-ATPase活力之间的关系，为虾肉的冷冻和冻藏提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活南美白对虾购于淄博水产品批发市场，虾体长度（10.50±0.65）cm，质量（11.24±1.50）g。

牛血清白蛋白、马来酸、三羟甲基氨基甲烷（trihydroxymethyl aminomethane，Tris）、Elon试剂、钼酸铵等国药集团化学试剂有限公司；三磷酸腺苷二钠美国Sigma公司；三氯乙酸（trichloroacetic aicd，TCA）天津市凯信化学工业有限公司；所用试剂均为分析纯；麦芽糊精（食品级）山东西王集团。

1.2 仪器与设备

T18 basic分散机德国IKA公司；DW-HL100、DW-FL90、DW-FL253低温/超低温冰箱中科美菱低温科技有限公司；FD-1B-80冷冻干燥机北京博医康实验仪器有限公司；SPX-250B-Z生化培养箱上海博迅实业有限公司；UV2102紫外-可见分光光度计上海精密科学仪器有限公司；GL-20G-Ⅱ冷冻离心机上海安亭科学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 样品准备

将南美白对虾去头、去壳后用搅拌机搅匀，将其平均分成6 份，其中3 份分别按虾肉质量添加5%麦芽糊精并混合均匀，得到的虾肉计作PV-MD；另外3 份为纯虾肉（PV）。取PV与PV-MD各1 份，作为鲜虾肉样品，其水分含量为（76.5±0.2）%；然后将另外4 份虾肉样品放入低温冰箱中冷冻24 h，将冷冻后样品分别置于冷冻干燥机中干燥（冷阱温度-80 ℃、真空度8 Pa）。通过控制冷冻干燥时间，将PV与PV-MD的湿基水分含量分别控制在（18.0±0.9）%与（6.5±1.5）%。根据文献[18]结果，水分含量分别为（76.5±0.2）%、（18.0±0.9）%和（6.5±1.5）%的虾肉样品分别代表鲜虾肉、含冻结水虾肉与单分子层水分含量值的虾肉。将3 种不同水分含量的虾肉均分别密封于自封袋中并置于-78、-35、-18 ℃与5 ℃条件下贮藏，定期取样测定虾肉的Ca2+-ATPase活力。每组实验做2 次平行。

1.3.2 Ca2+-ATPase活力的测定

采用曹淑敏等[21]的方法测定虾肉Ca2+-ATPase活力。实验做2 次平行，结果取其平均值。Ca2+-ATPase活力计算公式见式（1）。

式中：n1为1.0 mL反应液中生成的磷酸的物质的量/μmol；n2为空白组生成的磷酸的物质的量/μmol（即先加入1.0 mL 15% TCA使酶失活，再加ATP溶液，其他操作与处理组相同，640 nm波长处测定吸光度）；t为反应时间/min；m为1.0 mL反应液所含的酶蛋白质量/mg。

1.3.3 Ca2+-ATPase活力变化的动力学模型

虾肉Ca2+-ATPase活力变化的动力学模型采用化学反应动力学模型[22]，其表达式如式（2）。

式中：C为Ca2+-ATPase活力/（μmol Pi/（mg·min）；k为C a2+-A T P a s e活力变化速率常数；t为反应时间/d；n为反应级数，一般为0、1、2。

对于0、1、2级反应，式（2）可具体变换为式（3）～（5）。

式中：C0为C a2+-A T P a s e活力初始值/（μmol Pi/（mg·min））。

分别对C、ln C与1/C与贮藏时间t的关系进行线性回归分析，通过决定系数（R2）确定模型拟合精度，进而确定虾肉贮藏过程中Ca2+-ATPase活力变化的最适反应级数n。

虾肉Ca2+-ATPase活力变化速率常数与温度密切相关，可通过Arrhenius方程[23]表示，具体见式（6）。

式中：k0为频率因子；Ea为蛋白质变性反应的活化能/（J/mol）；R为气体常数，取值8.314 J/（mol·K）；T为绝对温度/K。

1.4 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 虾肉贮藏期间Ca2+-ATPase活力变化

湿基水分含量分别为（6.5±1.5）%、（18.0±0.9）%与（76.5±0.2）%的南美白对虾肉在不同温度（-78、-35、-18、5 ℃）贮藏期间，Ca2+-ATPase活力随时间变化如表1～3所示。

表1 贮藏温度对水分含量为（）%鲜虾肉Ca2＋-ATPase活力的影响Table1 Ca2+-ATPase activity of fresh Penaeus vannamei meat with moisture content of (76.5± 0.2)% at different storage temperatures

注：同一列中肩标不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）；空白项表示未安排实验。下同。

从表1～3可以看出，温度与水分含量对南美白对虾肉贮藏期间Ca2+-ATPase活力均有较大影响。虾肉水分含量相同时，Ca2+-ATPase活力随贮藏温度升高而降低，贮藏温度越低，酶活力下降速率越缓慢；当贮藏温度升高至5 ℃时，Ca2+-ATPase活力快速下降。例如，水分含量为18.0%的PV，在温度分别为-78、-35、-18、5 ℃条件下贮藏60 d时，Ca2+-ATPase活力比0 d时分别降低了19.31%、19.31%、23.45%与33.10%。相同贮藏温度时，虾肉水分含量越高，Ca2+-ATPase活力下降速率越快。例如，将水分含量分别为76.0%、18.0%与6.5%的PV置于-18 ℃条件下贮藏90 d时，Ca2+-ATPase活力比0 d时分别降低39.75%、28.28%与14.81%。相同水分含量的虾肉在相同温度下贮藏时，相同贮藏时间内PV-MD的Ca2+-ATPase活力下降幅度低于PV。例如，水分含量为76.0%的PV与PV-MD在温度为-35 ℃贮藏120 d时，其Ca2+-ATPase活力比0 d时分别降低31.06%与24.84%。因此，添加麦芽糊精能有效地缓解虾肉冻藏期间蛋白质冷冻变性的速率与程度。其原因可能是添加的麦芽糊精提高了虾肉的Tg与非冻结水分含量，进而降低了虾肉冻藏期间分子流动性[18]。

表2 贮藏温度对水分含量为（18.0±0.9）%的虾肉-ATPase活力的影响Table2 Ca2+-ATPase activity of Penaeus vannamei meat with moisture content of ()% at different storage temperatures

表3 温度对南美白对水分含量为（6.5±1.5）%的虾肉Ca2＋-ATPase活力的影响Table3 Ca2+-ATPase activity of Penaeus vannamei meat with moisture content of ()% at different storage temperatures

2.2 Ca2+-ATPase活性反应的动力学模型

分别采用方程（3）～（5）对表1、2与3的数据进行线性回归分析，模型拟合精度用R2判定。结果表明，虾肉贮藏过程中，Ca2+-ATPase活力变化遵循2级反应动力学，即1/C-1/C0＝kt，反应速率常数k如表4所示。可以看出，虾肉水分含量相同时，Ca2+-ATPase活力变化的反应速率常数k随着温度升高而增加，当温度较低时，k值变化速率较小；随着温度升高，k值显著增加（P＜0.05）。例如，PV-MD水分含量为76.5%时，当贮藏温度为-78 ℃时，k为0.018 6；当温度升高至-35 ℃与5 ℃时，k值分别增加至0.020 2（增加8.6%）与0.294 9（增加1 485.5%）。而当贮藏温度相同时，Ca2+-ATPase活力变化的k值随着水分含量增加而增加。例如，将水分含量分别为76.5%、18.0%与6.5%的PV-MD置于-18 ℃条件下贮藏时，其Ca2+-ATPase活力变化的k值分别为0.024 3、0.012 5与0.006 0。相同水分含量的虾肉在相同温度下贮藏时，PV-MD的Ca2+-ATPase活力变化的反应速率常数低于PV。例如，水分含量为18.0%的PV与PV-MD在温度为-35℃贮藏时，其k值分别为0.018 2与0.011 3。由此可知，添加麦芽糊精能降低虾肉贮藏过程中Ca2+-ATPase活力下降速率，即降低虾肉冻藏期间蛋白质变性反应的速率。虾肉水分含量分别为76.5%、18.0%与6.5%时，根据公式（6）计算可得PV与PV-MD蛋白质变性反应的活化能（表4）。虾肉蛋白质变性反应的活化能随着水分含量增加而降低；而相同水分含量时，PV-MD活化能高于PV。这说明虾肉水分含量越高，贮藏过程中蛋白质变性反应越容易发生，Ca2+-ATPase活力降低速率越快，下降幅度越大；虾肉水分含量相同时，添加麦芽糊精导致虾肉蛋白质变性反应的活化能提高；因此，Ca2+-ATPase活力降低的速率与幅度降低，这与Ca2+-ATPase活力、k值变化的结果基本吻合。

表4 不同温度与水分含量下的Ca2＋-ATPase活力变化速率常数Table4 Ca2+-ATPase reaction rate constant as a function of temperature and moisture content

2.3 Ca2+-ATPase活力反应机制

Shi Qilong等[24]采用静态称量法研究了PV与PV-MD在不同温度（5、15、25、35、45℃）和aw（0.112～0.931）条件下的吸附等温线与热力学特性，探讨了添加麦芽糊精对虾肉热力学特性影响。结果表明，GAB模型为描述虾肉水分吸附特性的最适模型，虾肉单分子层干基水分含量随麦芽糊精添加量的增加而增加，PV与PV-MD的干基水分含量范围分别为0.061 1～0.082 4 g/g与0.073 4～0.103 4 g/g。此外，Shi Qilong等[18]研究了南美白对虾肉的Tg与冻结点温度（TF），分别采用Gordon-Taylor方程与Chen’s方程拟合Tg和TF数据，构建了虾肉的状态图，探讨了添加麦芽糊精对南美白对虾肉贮藏稳定性的影响。结果表明，PV和PV-MD最大冷冻浓缩状态时的玻璃化转变温度T’g分别为-74.92 ℃和-67.69 ℃，冻结终了温度（或冰融起始温度）T’m分别为-32.25 ℃和-26.01 ℃。处于最大冷冻浓缩溶液状态的PV和PV-MD溶质含量分别为70.57%和65.69%，非冻结水含量分别为29.43%和34.31%[18]。Rahman[25-26]将aw保藏理论与玻璃化转变理论结合用于评估食品贮藏稳定性，并提出临界温度概念。Rahman等[27]研究表明，与aw保藏理论相比，玻璃化转变理论更适用于描述石斑鱼贮藏过程中脂质氧化进程。基于aw保藏理论和玻璃化转变理论，可通过分析虾肉贮藏期间Ca2+-ATPase活力变化的k值与aw、Tg的关系，同时结合文献[18]中虾肉的状态图，推断出虾肉在贮藏期间的蛋白质变性机制。

图1 PV（a）和PV-MD（b）在冻藏期间（T－Tg）与速率常数k的关系曲线Fig.1 Rate constant k of PV (a) and PV-MD (b) as a function of T−Tg

贮藏温度、虾肉水分含量与Ca2+-ATPase活力变化的k值的关系曲线如图1、2所示。由图1可以看出，对于PV与PV-MD，k随着贮藏温度T与虾肉Tg之间的差值（T-Tg）的增加而增加。对于PV而言，样品水分含量分别为76.0%和18.9%时，其对应的Tg分别为-74.9 ℃和-51.0 ℃[18]。当T-Tg分别为39.9 ℃和16.0 ℃时，曲线出现拐点，这意味着虾肉的贮藏温度在Tg附近时，反应速率出现了明显变化（图1a）。对于PV-MD，样品水分含量分别为76.5%和18.0%时，其对应的Tg分别为-67.7 ℃和-25.7 ℃[18]。当T-Tg分别为32.7 ℃和7.74 ℃时，曲线出现拐点（图1b）。对于PV与PV-MD，当其水分含量分别为5.0%和8.1%时，其对应的Tg分别为10.8 ℃和15.0 ℃。5 ℃贮藏时，因贮藏温度低于虾肉的Tg，样品处于玻璃态，所以k值变化较小，曲线未出现明显拐点。综上所述，当贮藏温度处于Tg附近时，PV与PV-MD的k值均呈明显突变（增加）的规律。由此可以证实，虾肉贮藏期间Ca2+-ATPase活力变化与玻璃化转变理论密切相关。

对于PV与PV-MD，k值随着虾肉的干基水分含量与单分子层水分含量比值（Xw/Xm）变化曲线如图2所示。水分含量对k值的影响受到温度的制约。当贮藏温度分别为-78、-35、-18 ℃时，样品水分含量对反应速率常数k影响不大。然而，贮藏温度为5 ℃时，PV在Xw/Xm等于2.30附近出现拐点，而PV-MD未出现明显拐点。说明反应速率常数k受到虾肉的水分含量与贮藏温度的双重影响，同时也与虾肉组成成分密切相关。

综上，虾肉在冻藏过程中，蛋白质变性的速率和程度主要受到贮藏温度与Tg差值的影响，添加麦芽糊精能有效地减缓蛋白质变性速率，而虾肉的水分含量对蛋白质变性速率的影响低于贮藏温度的影响。虾肉5 ℃冷藏过程中，蛋白质变性的速率和程度既受到虾肉水分含量的影响，同时也与虾肉的组成成分密切相关。

图2 PV（a）和PV-MD（b）在冻藏期间Xw/Xm与速率常数k的关系曲线Fig.2 Rate constant as a function of Xw/Xm of PV (a) and PV-MD (b)

冷冻是水产品保藏常采用的方法，但是在冻藏过程中，冰结晶成长、重结晶、细胞结构损伤、蛋白质变性、聚集等现象导致水产品质地、风味、色泽等品质降低[28]。这些受分子扩散运动控制的反应与玻璃化转变理论密切相关。水产品冻结过程中，冰晶体数量随贮藏温度降低而增多，液相中溶质浓度与基质黏度不断增加，当温度降低到一定程度时，液相水不再结冰，此时体系状态称为玻璃态，对应的温度为T’g。Shi Qilong等[18]的研究结果表明，南美白对虾肉T’g随麦芽糊精添加而提高。因此，相同温度下贮藏时，添加麦芽糊精的虾肉体系黏度高于PV，体系流动性降低，蛋白质变性等受分子扩散控制的反应速率相应降低。此外，蛋白质冷冻变性程度同时也受到蛋白质与水分相互作用的显著影响，二者作用力越强，蛋白质结构越稳定[29]。水产品中非冻结水含量对于肌原纤维蛋白质结构稳定性与功能特性影响较大，添加蛋白质酶解物能显著提高水产品冻藏期间非冻结水含量，进而促进肌原纤维蛋白结构稳定[30]。Shi Qilong等[18]的研究结果表明，南美白对虾肉中非冻结水含量随麦芽糊精添加而提高。因此，添加麦芽糊精使虾肉贮藏期间蛋白质与水作用力增强，稳定了蛋白质的结构，进而减缓了蛋白质冷冻变性速率。未来研究应偏重于水分在冻藏过程中状态、分布及其对蛋白质分子结构稳定性与功能特性影响。

3 结论

南美白对虾肉贮藏期间，虾肉水分含量与贮藏温度对Ca2+-ATPase活力都有较大影响。虾肉Ca2+-ATPase活力随温度升高、水分含量增加而降低。

南美白对虾肉贮藏过程中，Ca2+-ATPase活力变化遵循2级反应动力学，即1/C-1/C0＝kt，k随温度升高、水分含量增加而增加。

虾肉冷冻、冻藏过程中，蛋白质变性的速率和程度主要受到贮藏温度与Tg差值的影响，添加麦芽糊精能有效地减缓蛋白质变性速率，而虾肉的水分含量对蛋白质变性的速率影响要低于贮藏温度对其的影响。虾肉在5 ℃冷藏过程中，蛋白质变性的速率和程度既受到虾肉水分含量的影响，同时也与虾肉的组成成分密切有关。

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