T-2毒素对凡纳滨对虾DNA黏度损伤效应

宁守强，王雅玲,*，王小博，邱 妹，孙力军，郭俊豪，潘晓梅，励建荣*

（1.广东海洋大学食品科技学院，广东省水产品加工与安全重点实验室，广东普通高等学校水产品深加工重点实验室，广东 湛江 524088；2.渤海大学 辽宁省食品安全重点实验室，辽宁 锦州 121013）

T-2毒素是单端孢霉烯族毒素之一。该毒素毒性强烈，在自然界中广泛存在，严重危害人畜健康[1]。T-2毒素的化学性质稳定，有研究报道T-2毒素常温放置6～7 年或高温至200 ℃，毒力仍无减弱[2]。T-2毒素可通过污染动植物性食品而进入食物链，主要危害动物的造血组织和免疫器官，引起出血性综合征，出现白细胞减少、贫血，使胃肠道功能受损等[3-4]。

目前研究发现T-2毒素可以通过诱导DNA链的断裂，破坏其完整性，抑制蛋白质合成，进而抑制DNA合成[5]。DNA作为大多数有毒有害小分子的作用靶分子，其分子结构及空间结构能否保持稳定和完整，对机体细胞活性和生理功能的正常发挥具有重要意义[6]。有研究表明多数小分子毒物可通过与DNA高度结合影响其空间结构[7]。李瑜等[8]发现农药西玛津可以使小牛胸腺DNA紫外光谱发生减色作用，并且还使得DNA的熔点和黏度增大。但是有关T-2毒素对DNA的互作信息鲜有报道。特别是本课题组前期研究发现T-2毒素染毒的对虾饲料可以抑制对虾生长[9]，导致品质劣化[10]，但是有关T-2毒素对凡纳滨对虾DNA黏度损伤效应鲜见报道。

T-2毒素的暴露剂量和DNA质量浓度及其二者互作的时间是揭示T-2对DNA黏度损伤效应的重要参数。科学的实验设计是揭示其作用规律的前提。响应面分析是一种应用较为广泛的试验优化方法，通过合理的试验设计，采用多元二次回归方程拟合，能以最为简单有效的方式对试验进行全面研究，是解决多因子问题的一种统计手段，从而确定最佳条件[11]。因此，本研究首先通过响应面法分析T-2毒素对小牛胸腺DNA的最适作用条件，再通过体外T-2毒素与对虾DNA作用验证，最后通过喂食对虾T-2毒素进行蓄积染毒后，进而揭示T-2毒素对对虾DNA黏度的影响。为阐明T-2毒素对对虾DNA的危害提供理论参考，并且对探讨T-2毒素的毒理作用具有一定的研究意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活凡纳滨对虾购自湛江东风市场。

海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒 北京康为世纪生物科技有限公司；Tris 北京鼎国生物技术有限责任公司；氢氧化钠 西陇化工股份有限公司；T-2毒素（纯度≥99%） 美国Enzo公司；所有分离用有机溶剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

Centrifuge 5417R冷冻离心机 德国Eppendorf公司；TU-1901双光束紫外-可见分光光度计、乌氏黏度计 北京普析通用仪器有限责任公司；GelDoc 2000凝胶成像系统美国Bio-Rad公司；LS-B50L立式压力蒸汽灭菌器 上海华线医用核子仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 单因素试验

取1.3 ng/mL T-2毒素4 μL和60 μg/mL小牛胸腺DNA 30 μL混合，用TE缓冲液定容至3 mL，反应时间为：1、5、10、20、30、40、50 min和60 min，考察反应时间对DNA黏度的影响；反应时间设为40 min，小牛胸腺DNA质量浓度60 μg/mL，T-2毒素质量浓度分别为0.15、0.70、1.30、2.70、3.50 ng/mL，考察T-2毒素质量浓度对DNA黏度的影响；反应时间40 min，T-2毒素质量浓度为2.70 ng/mL，小牛胸腺DNA质量浓度分别为30、40、50、60、70、80 μg/mL，考察DNA质量浓度对黏度的影响。

1.3.2 响应曲面试验

在单因素试验基础上，选取T-2毒素质量浓度（A）、DNA质量浓度（B）、反应时间（C）共3 个因子，以DNA的A260nm为响应值，采用三因素三水平的响应面分析法，得到二次回归方程，并找出最佳的试验条件。

1.3.3 T-2毒素经口染毒对虾实验

采用微胶囊毒饵料制备技术[12]分别配制T-2毒素的含量为12.2、4.8、2.4、1.2 mg/kg和0.5 mg/kg的对虾毒饵料；设置未染毒对虾为空白对照组，对凡纳滨对虾进行饲喂，周期为20 d。

1.3.4 对虾肌肉和肝胰腺DNA提取和检测

海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒法提取对虾肌肉和肝胰腺的DNA：其中要求无水乙醇在-20 ℃中预冷后使用，提取后的DNA于-20 ℃中保存。

凝胶电泳法检测提取的DNA质量浓度，采用1%琼脂糖，凝胶厚度3～5 mm，80 V电泳40 min。

吸光度法测定对虾肌肉和肝胰腺的DNA质量浓度：取30 μL DNA提取物，用TE缓冲液稀释10 倍，分别测定其在260 nm和280 nm波长处的吸光度。A260nm/A280nm在1.8～2.0之间说明基本不含蛋白质，其纯度满足实验要求。按下式计算DNA质量浓度。

DNA质量浓度/（ng/μL）＝50×A260nm×稀释倍数

1.3.5 DNA黏度的测定

根据响应面试验优化的条件，将50 μg/mL对虾肝胰腺DNA以及稀释10 倍的肝胰腺和肌肉原DNA提取液，体外分别与3.50、2.70、1.30、0.70、0.15 ng/mL T-2毒素反应，反应时间为43 min，乌氏黏度计法检测DNA黏度。

第21天分别提取染毒对虾肝胰腺的DNA，调整DNA质量浓度50 μg/mL，乌氏黏度计法检测DNA黏度。分析对虾DNA黏度变化与T-2毒素暴露剂量之间的相关性。

将乌氏黏度计置于25 ℃恒温水浴锅中，分别测定TE缓冲液、DNA溶液和T-2毒素-DNA混合液流经毛细管达到热平衡点所用时间。以（η/η0）1/3分别对反应时间、T-2毒素质量浓度、DNA质量浓度作图，得到DNA黏度变化趋势（η为T-2毒素-DNA混合液黏度；η0为溶剂黏度）。

1.4 数据统计分析

采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，P＜0.05时认为组间差异显著。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 反应时间对DNA黏度的影响

图1 反应时间对DNA黏度的影响Fig.1 Effect of incubation time on the viscosity of DNA

由图1可以看出，随着反应时间的延长DNA黏度增加，反应40 min时，DNA黏度趋于最大值，此后随时间延长DNA黏度几乎无变化。DNA黏度与反应时间成正比，在一定时间范围内，反应时间越长DNA黏度升高越明显，最终随着反应的完成，DNA黏度几乎不再发生变化，并且随着反应时间的延长还可能引起DNA分解，因此本实验选择反应时间为40 min。

2.1.2 T-2毒素质量浓度对DNA黏度的影响

图2 T-2毒素质量浓度对DNA黏度的影响Fig.2 Effect of T-2 toxin concentration on the viscosity of DNA

由图2可知，当DNA质量浓度为60 μg/mL时，DNA黏度随着T-2质量浓度升高明显增加，在1.30 ng/mL时，DNA黏度趋近于最大值，此后，随着T-2毒素质量浓度的升高DNA黏度下降。在此反应中，当T-2毒素为1.30 ng/mL时，其与DNA反应完全，DNA黏度达到最大值，因此本实验选择的T-2毒素质量浓度为1.30 ng/mL。

2.1.3 DNA质量浓度对DNA黏度的影响

由图3可知，在0～50 μg/mL范围内随着DNA质量浓度增加黏度升高，在50 μg/mL时DNA黏度达到最大值，此后随着质量浓度增加黏度降低。这可能是由于在50 μg/mL时T-2毒素对DNA的损伤作用最大，反应最完全，而随着DNA质量浓度的增大，T-2毒素完全反应，而未受损伤的DNA比例增加，故而造成黏度的下降；因此本实验选择的DNA质量浓度为50 μg/mL。

图3 DNA质量浓度对DNA黏度的影响Fig.3 Effect of DNA concentration on the viscosity of DNA

2.2 响应面试验结果

2.2.1 二次响应面回归方程的建立与分析

表1 响应面试验设计与结果Table1 Experimental design with results for response surface analysis

由表1可知，应用Design-Expert软件进行回归拟合分析，可得到T-2毒素质量浓度（A）、DNA质量浓度（B）、反应时间（C）与DNA黏度（Y）之间的二次多项式模型为：Y＝1.96+0.069A-0.044B+0.030C+0.038AB+0.045AC+0.040BC-0.12A2-0.15B2-0.14C2。

由表2可知，回归模型具有高度显著性（P＜0.000 1），失拟项不显著（P＝0.654 3＞0.05），R2＝0.981 6，＝0.957 9。说明方程对实验拟合较好[13-14]。变异系数（CV）反映模型的置信度，CV值越低，模型的置信度越高。本实验CV值为1.71%，说明其置信度较高，模型方程可以较好地反映真实的实验值，可用此模型分析相应值的变化。回归方程各项方差分析表明，因素A、B、A2、B2、C2对DNA黏度有极显著影响（P＜0.01），因素C、AB、AC、BC对DNA黏度有显著影响（P＜0.05）。

表2 回归方程系数显著性检验Table2 Significance test of regression equation coefficients

2.2.2 两因子交互作用分析

通过Design-Expert软件对各因素之间的交互作用进行响应面分析，绘制响应面曲线，显示了T-2毒素质量浓度、DNA质量浓度、反应时间中任意一个变量取零水平时，其余两个变量对DNA黏度的影响。其中等高线为椭圆形表示两因素交互作用显著[15]。由图4可知，T-2毒素质量浓度与DNA质量浓度、T-2毒素质量浓度与反应时间、DNA质量浓度与反应时间的交互作用对DNA黏度均有显著影响。

图4A为反应时间40 min时，T-2毒素质量浓度与DNA质量浓度对DNA黏度的交互作用。当DNA质量浓度一定时，在T-2毒素低质量浓度范围内，随着质量浓度增加DNA黏度先增加，当T-2毒素质量浓度超过一定值时，DNA黏度随之开始降低。T-2毒素质量浓度一定时，随着DNA质量浓度的增加，DNA黏度先增大，但当DNA质量浓度超过一定值时，DNA黏度呈下降趋势。图4B中当反应时间一定时，随着T-2毒素质量浓度增加，DNA黏度升高，当T-2毒素质量浓度超过一定值时，DNA黏度随之降低。图4C中，当反应时间一定时，随DNA质量浓度的增加，同样DNA黏度先升高后下降。

图4 任意两变量对DNA黏度影响的响应曲面图Fig.4 Response surface plots showing the interactive effects of variables on DNA viscosity

2.2.3 最佳条件的预测与验证

通过回归模型的预测，得到T-2毒素对DNA黏度影响最明显的条件为：T-2毒素质量浓度2.70 ng/mL、DNA质量浓度50.15 μg/mL、反应时间42.78 min。此时理论上最高的DNA黏度为1.924 9，结合实际调整实验条件为T-2毒素质量浓度2.70 ng/mL、DNA质量浓度50 μg/mL、反应时间43 min。在此条件下进行3 次重复实验，平均DNA黏度为1.850 0，实际值与预测值相差0.074 9，证实了模型的有效性。

2.3 T-2毒素体外作用对对虾DNA黏度的影响

图5 空白组DNA琼脂糖凝胶电泳图Fig.5 Electrophoresis of DNA in the blank group

从图5中可以看到条带明亮，说明提取的肝胰腺DNA和肌肉DNA纯度高，肝胰腺DNA的A260nm/A280nm为1.891，肌肉DNA的A260nm/A280nm为1.854，提取的对虾肝胰腺DNA质量浓度为872 μg/mL，肌肉DNA质量浓度为393 μg/mL。对虾肝胰腺内DNA的提取质量浓度远大于肌肉的，表明同质量肝胰腺组织内的DNA质量浓度明显高于肌肉组织。

图6 体外加入不同质量浓度T-2毒素对对虾DNA黏度的影响Fig.6 Effect of T-2 toxin concentration in vitro on viscosity of shrimp DNA

由图6可知，50 μg/mL肝胰腺DNA的黏度的变化趋势随着T-2质量浓度的增加而增大，当T-2毒素质量浓度为2.70 ng/mL时，DNA黏度达到最大值，T-2毒素小分子中具有强电负性的羟基与羰基，会被DNA两侧的带电磷酸基团吸附，紧密包围在核酸表面，这种包裹作用可能增加了T-2毒素上O—H与嘧啶和嘌呤的N原子和O原子的接触，增加了形成氢键的可能[16-17]。碱基对之间的氢键对维持DNA双链结构的稳定起主要作用。同时T-2毒素作为一种脂溶性分子，具有一定的疏水作用[18]，所有氢键的形成和疏水作用都对DNA双链产生拉伸作用，从而使DNA双链的间距增大，引起DNA黏度的增加[19]。同时外源化合物以嵌插结合的方式与DNA作用，可以引起DNA相邻碱基对之间的距离增大，使双螺旋延长，从而致使DNA黏度增大[20-22]。这也说明T-2毒素与DNA通过嵌插的方式结合。此后随T-2毒素质量浓度的增加呈下降趋势。这可能是因为随着T-2毒素的增加，两者的作用更加充分，DNA骨架磷酸负电荷被中和，此时DNA会弯曲凝聚而沉淀出来，随着DNA的凝聚不断分离，引起DNA黏度的下降[16,23-24]。还可能是由于随着DNA质量浓度的增加，T-2毒素完全反应，相对未反应的DNA比例增加，因此造成黏度的下降。汪学德等[25]发现小分子化合物芝麻素及其衍生物能够促使DNA黏度的升高，当达到一定之后，DNA黏度变化趋于稳定。这与本研究的实验结果相似，在一定量的小分子化合物T-2毒素范围内，T-2毒素能够促使DNA黏度的升高，而超过一定值后，DNA黏度呈下降趋势，可能因为过量芝麻素及其衍生物与DNA不再发生反应，而过量的T-2毒素因含有电荷可继续与DNA反应造成的。T-2毒素质量浓度的变化对稀释10 倍的原肝胰腺DNA提取液的黏度的影响较稀释10 倍的原肌肉DNA提取液的明显。因肝胰腺内DNA的含量更高，并且肝胰腺是对虾对外源化合物的主要解毒器官和储藏器官，因此推测对虾的肝胰腺为T-2毒素进攻的靶器官。

2.4 T-2毒素经口对对虾DNA黏度的影响

由图7可知，空白组的条带亮度明显高于剂量组，同时测定空白组和剂量组对虾提取的肝胰腺DNA的A260nm/A280nm，分别为1.947、1.506、1.259、1.249、1.363、1.379。DNA质量浓度分别为858、651、662、638、597、684 μg/mL，剂量组DNA的A260nm/A280nm均小于1.6，而空白组DNA的A260nm/A280nm为1.947，并且提取的剂量组DNA质量浓度也明显低于空白组的，因相同的提取条件故可以排除提取过程中DNA的污染，可以推测是样品本身中存在对DNA有作用的物质。有研究表明T-2毒素引起机体氧化应激而产生醛类物质，由于醛类物质的吸收峰覆盖了DNA的吸收峰[26-27]。覆盖DNA原本的吸光度，从而引起A260nm和A280nm的变化，造成A260nm/A280nm降低。

图7 各T-2毒素剂量组DNA琼脂糖凝胶电泳图Fig.7 Electrophoresis of DNA from shrimps exposed to different doses of T-2 toxin

图8 各T-2毒素剂量组对虾肝胰腺DNA黏度的变化Fig.8 Changes in DNA viscosity in liver and pancrea tissues from all dose groups

由图8可知，不同剂量组对虾体内DNA黏度有着明显的差异，剂量组对虾DNA黏度整体较空白组高，实验结果与小牛胸腺DNA实验和体外实验具有大致相似的影响，T-2毒素不管在体内或者体外几乎都会引起对虾DNA黏度整体上升。但是DNA黏度的变化趋势存在差异，比如0.5 mg/kg剂量组的DNA黏度较1.2 mg/kg剂量组的高，在2.4 mg/kg剂量组对虾DNA黏度低于空白组。推测可能为：剂量组利用T-2毒素喂养对虾20 d，对虾机体内含有DNA修复酶会对损伤的DNA进行一定自我修复[28]；另外有研究表明，当T-2毒素进入体内后，在肝脏等一些解毒器官内发生代谢转化，如脱乙酰作用、羟基化作用、脱环氧化作用等，变成其他形式的T-2毒素，如mT-2s（隐蔽态T-2毒素）、HT-2、T-2醇等[29-30]。所以当T-2毒素进入对虾体内后，可能一部分被各种转化反应代谢成其他物质，其中某些物质以更多样的方式与DNA作用，从而对剂量组对虾体内DNA黏度的变化造成干扰。

3 结 论

采用Design-Expert软件的中心组合设计方法设计响应面试验，建立二次多项式数学模型，优化出对DNA黏度影响最明显的反应条件：T-2毒素质量浓度为2.70 ng/mL、DNA质量浓度为50 μg/mL、反应时间为43 min。

因为T-2毒素小分子中具有强电负性的羟基与羰基可能会被DNA两侧的带电磷酸基团吸附；T-2毒素上O—H可能与嘧啶和嘌呤的N原子和O原子接触形成氢键；同时T-2毒素还可能通过嵌插的方式与DNA结合。

体外实验中，体外T-2毒素与对虾DNA作用，随着T-2毒素质量浓度的增加，DNA黏度随之增大，在T-2毒素质量浓度为2.70 ng/mL时达到最大值，此后降低；在体内实验中，喂食对虾T-2毒素进行蓄积染毒对对虾DNA黏度的影响无明确规律，与体外对虾DNA实验结果并不相似。可能是由于T-2毒素经过体内复杂的反应，与其他物质加合后作用于DNA引起的，这还需要进一步研究。

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