miRNAs对胞质附着蛋白1表达调节的研究进展

岑胜壬，黄巧冰

(1南方医科大学第一临床医学院,广州510515；2南方医科大学基础医学院)

微小RNAs(miRNAs)在调节肿瘤的发生发展、上皮细胞的间质转化及细胞凋亡等方面起重要作用。胞质附着蛋白1(ZO-1)是紧密连接相关蛋白，近年来研究发现，ZO-1与维持细胞形态和肠黏膜屏障功能等有关。有研究发现，miRNAs可调控ZO-1等表达而调节肿瘤的迁移、血脑屏障和肠屏障等的功能[1]。现就miRNAs对ZO-1表达的调节作用研究进展综述如下。

1 微小RNAs与胞质附着蛋白(ZOs)的关系

微小RNAs(miRNAs)是一类长度19～25个核苷酸高度保守的内源性非编码小分子RNA。miRNAs能特异性识别作用于靶基因的3′末端非翻译区(3′UTR)，调控靶基因mRNA降解或翻译，多在基因的转录后水平起作用。根据miRNA-mRNA 结合的互补性，miRNAs的调控机制分为完全互补和部分互补，使得1个miRNA可调控多个靶基因，单一靶基因可同时被多个miRNAs调控，由此构成了miRNAs对生理过程的复杂调控网络。近年研究表明，miRNAs在哺乳动物细胞分化、增殖和凋亡等生理过程中的表达发生明显改变，在糖尿病控制、肿瘤治疗、心血管疾病等人类重大疾病治疗的相关基因表达中起重要调节作用[1]。

ZOs是第一个被证实的紧密连接附着蛋白，相对分子质量约225 kD，属于膜结合鸟苷酸环化酶激活蛋白(MAGUK)家族，主要包括ZO-1、ZO-2、ZO-3三个亚型。ZO-1主要由下列结构域组成：PDZ结构域、SH3(Src同源3)结构域、鸟苷酸激酶(GUK)结构域[2]。ZO-1是构成紧密连接的主要胞浆蛋白，在维持血脑屏障和肠上皮屏障稳定中起重要作用。

ZO-1等细胞间连接蛋白的正常表达有利于维持细胞的正常形态，ZO-1等的表达改变参与上皮间质转化，改变细胞的形态，影响细胞间的黏附力，而肿瘤细胞由于间充质转化和细胞形态改变，导致其转移和侵袭能力提高，因此研究ZO-1表达调节的通路，有利于明确肿瘤的发生发展机制。miRNAs主要在基因的转录后水平调节，1个基因可有多个miRNA调节，1个miRNA亦可调节多个靶基因。miRNAs参与多种细胞生理活动，在不同微环境下，miRNAs可对ZO-1等紧密连接蛋白的表达进行正向和负向调节，从而参与不同的病理生理过程。近年研究表明，miRNAs通过调节ZO-1等紧密连接蛋白的表达，影响内皮细胞屏障、肠屏障和血脑屏障等的结构和功能[3]。

2 miRNAs调控ZO-1表达与肠屏障的关系

肠屏障是一道间隔肠内容物与机体的屏障，主要由肠上皮细胞及细胞间连接构成，在维护机体内环境的稳定中起重要作用。近年来研究发现，miRNAs调节ZO-1对维持肠上皮屏障的稳定发挥重要作用。Tang等[4]发现，喂食过量乙醇的小鼠，iNOs表达上调导致肠黏膜细胞miR-212高表达，后者进而下调肠上皮ZO-1表达，阐明了乙醇导致肠渗漏的新机制。Zou等[5]发现，在Caco-2细胞中长链非编码RNA H19过表达而上调miR-675，使ZO-1和E-cadherin的mRNA降解和蛋白合成受抑，导致肠黏膜屏障功能失调，而RNA结合蛋白HuR过表达可抑制H19导致的肠上皮屏障功能失调。在诱导肠屏障损伤中，过表达miR-34c可抑制长链非编码RNA PlncRNA1表达，并抑制靶基因MAZ表达从而抑制ZO-1和Occludin的mRNA和蛋白表达，导致肠屏障损坏，而过表达PlncRNA1则可抑制miR-34c表达，保护肠屏障，该研究为治疗炎性肠病奠定了基础[6]。炎性肠病中，TNF-α能诱导肠上皮细胞损伤，使miR-191a上调导致其靶基因ZO-1的mRNA和蛋白表达下调，黄芩苷可抑制TNF-α诱导的miR-191a表达，提高ZO-1表达，从而防止TNF-α诱导的肠细胞损伤[7]。

3 miRNAs调控ZO-1表达与血肿瘤屏障(BTB)的关系

脑的微血管内皮细胞和其间的紧密连接蛋白如闭锁蛋白(Claudins)及紧密连接相关蛋白等构成了血脑屏障(BBB)，细胞间的紧密连接是BBB的结构和功能基础，在控制血液与脑的营养物质交换中起重要作用[8]，而ZO-1是BBB内皮细胞连接结构的重要组成成分。BTB，尤其是脑胶质瘤的BTB，与BBB相似，BTB的存在使肿瘤治疗药物不能进入或进入的药物浓度达不到治疗剂量，导致脑肿瘤不能得到有效治疗，所以增加BTB通透性有利于药物进入，增加疗效。ZO-1作为紧密连接蛋白组成成分，下调ZO-1的表达会影响紧密连接结构，从而提高BTB通透性，增强肿瘤治疗效果。已有大量研究证明miRNAs功能变化是肿瘤发生发展的重要机制之一，而多种肿瘤中发生表达变化的miRNAs亦可通过多种机制间接调控ZO-1表达，从而调节BTB的通透性，影响肿瘤的进程及治疗效果。

有研究发现，在胶质瘤微血管内皮细胞(GECs)中miR-181a表达较正常内皮细胞上调，外源性给予pre-miR-181a过表达miR-181a后，通过抑制其靶基因KLF-6表达，进而阻止KLF-6与ZO-1、Claudin-5和Occludin的启动子结合，导致mRNA和蛋白质表达进一步下降并使紧密连接结构不连续，进而提高BTB的通透性[9]；该研究还发现，miR-34c在GECs中的表达较正常脑血管内皮细胞明显升高，通过质粒转染过表达miR-34c，抑制靶基因MAZ，降低紧密连接相关蛋白ZO-1、Claudin-5和Occludin表达，从细胞旁途径调节提高BTB的通透性[10]；他们还发现GECs中miR-34a较正常ECs显著上升，转染质粒过表达miR-34a使p-PKC-ε、PKC-ε蛋白水平下降，而不是mRNA水平下降，导致ZO-1、Claudin-5和Occludin表达减少和分布改变，从而进一步提高BTB通透性[11]；这些研究为胶质瘤的治疗提供了新靶点，但未就miR-181a、miR-34c和miR-34a表达较正常ECs上升的具体机制进行探讨，作者只是推测可能与肿瘤微环境释放各种因子有关。Cai等[12]研究发现，长链非编码RNA TUG1 在胶质瘤血管内皮细胞中高表达，抑制TUG1表达可提高miR-144表达，miR-144可直接抑制热休克转录因子2表达，导致ZO-1、Occludin和Claudin-5表达下调及TJs分布不连续，从而提高BTB通透性。在GECs中miR-18a低表达，而过表达miR-18a则抑制其靶基因RUNX1表达，使RUNX1不能与ZO-1、Occludin和Claudin-5的启动子结合，导致ZO-1等表达下调和分布改变，从而增加BTB的通透性，miR-18a和RUNXl可作为抗肿瘤药物通过BTB的潜在靶点，为胶质瘤的治疗提供新策略[13]。敲除GECs中长链非编码RNA MALAT1上调miR-140表达，上调的miR-140抑制核因子YA(NFYA)表达，导致ZO-1、Occludin和Claudin-5的启动子活性下降，从而使ZO-1等mRNA和蛋白表达下降，破坏TJs从而提高BTB通透性[14]。Liu等[15]发现，在GEC中miR-330过表达，低剂量内皮单核细胞活化多肽Ⅱ(EMAPⅡ)通过抑制miR-330-3p表达，上调靶基因PKC-α和p-PKC-α的活性，导致TJs相关蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-5表达减少，从而使BTB通透性增加。

4 miRNAs调控ZO-1表达与肿瘤发生和转移的关系

miRNAs在肿瘤的增殖凋亡和转移中起重要调节作用。上皮间质转化(EMT)是一个复杂过程，上皮细胞骨架重构失去上皮特征结构而表达间充质细胞的标志物，即上皮细胞间连接蛋白ZO-1等减少而波形蛋白等表达增多，使细胞移动和侵袭能力增强，在肿瘤发生和肿瘤转移中起重要作用[16]。有研究提示，miRNAs通过调节ZO-1表达而控制肿瘤的转移和侵袭。另有研究发现，部分miRNAs如miR-9、miR-105和miR-19可下调ZO-1等表达，促进EMT发生，从而导致肿瘤的发生和侵袭；而部分miRNAs如miR-34a、miR-122和miR-203则可上调ZO-1的表达，从而发挥抑制肿瘤发生和侵袭的作用。Miao等[17]用miR-203模拟物处理胰腺癌细胞24 h使ZO-1、Snail和β-Catenin表达上升，并通过Caveolin-1抑制Zeb-1、波形蛋白，纤连蛋白表达而抑制EMT，抑制胰腺癌细胞迁移和侵袭。在肝细胞癌的有关研究中，转录因子HNF4α的激活可诱导靶基因miR-122表达，miR-122直接抑制RhoA表达，RhoA/Rock通路受抑制，导致ZO-1等紧密连接蛋白和黏附链接蛋白表达上升，而纤维连接蛋白和波形蛋白等表达下降，逆转EMT，减少肝癌细胞的运动性和侵袭能力，为肝癌治疗提供了新方法[18]。在非小细胞肺癌中，miR-129-1-3p过表达可直接抑制促癌因子微球粒蛋白1(MCRS1)表达，使ZO-1、Occludin和DSG2等表达上调，阻止EMT，抑制癌细胞转移和侵袭[19]。研究[20]发现，miR-638在结直肠癌中低表达，过表达miR-638通过直接抑制SOX2来提高ZO-1、E-Cadherin等上皮样特征蛋白的表达，而抑制EMT，从而抑制肿瘤的转移和侵袭。乳腺癌细胞分泌富含miR-105的外泌体，抑制靶基因ZO-1等紧密连接黏附蛋白表达，破坏血管内皮屏障，提高血管内皮细胞的通透性，促进肿瘤的远处转移(肺和脑)；通过抑制miR-105，可提高ZO-1等表达，抑制肿瘤肺脑转移，但不改变肿瘤大小[21]。肺癌细胞缺氧条件下，通过分泌外泌体miR-23a抑制靶基因PHD1/2表达，进而促进HIF-1α表达。miR-23a过表达还可降低ZO-1表达，导致血管新生和内皮细胞通透性增高[22]。

5 miRNAs调控ZO-1表达与其他疾病发生发展的关系

miRNAs对ZO-1的调节除了在BTB和肿瘤的发生和转移中发挥重要作用外，在其他疾病的病理生理过程亦发挥重要作用。研究发现，用角质细胞模拟皮肤创面生物膜感染时诱导产生miR-106b和miR-146a，miR-146s能直接抑制ZO-1和ZO-2表达，miR-106b可通过作用于外显子或5′端抑制ZO-2和ZO-1表达而损害皮肤屏障功能。可通过抑制miR-106b和miR-146a表达，为处理慢性伤口提供新方法[23]。在烧伤老鼠中miR-98过表达抑制FIH-1表达，使HIF-1过表达，导致ZO-1蛋白表达减少，进而导致器官微血管屏障损坏，通透性增高，故在烧伤后，miR-98调节FIH表达的通路可作为保护血管屏障功能的靶点[24]。小鼠脑缺血模拟中风后，抑制miR-155表达后，可使Rheb表达上调，抑制Akt活性，而减少ZO-1降解稳定TJs，保护BBB的完整性，可通过抑制miR-155表达为治疗脑缺血引起的中风提供方向[25]。用Niaspan治疗大鼠糖尿病视网膜病变时，提高miR-126表达，使靶基因Ang-1表达上升，并抑制靶基因VEGF/VEGFR和VCAM-1的表达，从而提高视网膜血管细胞的ZO-1、Claudin-5和Occludin表达，维持血视网膜屏障稳定减缓DR进程[26]。视网膜细胞在高糖条件下，过表达miR-15a/16可显著下调TGF-β3和SMAD2/3水平，并通过降低VEGF水平，提高ZO-1和Occludin表达，降低视网膜内皮细胞的通透性，保护视网膜内皮屏障[27]。

综上所述，ZO-1是构成紧密连接蛋白的成分，参与维持血脑屏障、肠上皮屏障和血视网膜屏障等的稳定。miRNAs通过调节ZO-1等紧密连接蛋白表达，在肿瘤侵袭和迁移、血肿瘤屏障通透性及肠上皮间充质转化的调节中发挥重要作用，阐明miRNAs调节ZO-1表达的机制，可为治疗疾病提供多个靶点，改善疾病预后。