MMSET在卵巢高级别浆液性癌组织中表达及其对癌细胞侵袭迁移的影响

陈颖,刘鑫慧,毕芳芳,杨清

(中国医科大学附属盛京医院, 沈阳110004)

卵巢癌(OC)是女性常见恶性肿瘤之一，发病率及病死率高。美国癌症协会预计，2018年美国将新增卵巢癌病患22 240例，死亡病患14 070例[1]。在中国据估计,2015年全国卵巢癌新发病例约5.21万例,死亡病例约2.25万例[2]。上皮性卵巢癌(EOC)是卵巢癌中最常见的病理类型，其中卵巢高级别浆液性癌(HGSC)占70%。虽然近年HGSC治疗取得一定进展，但病死率仍较高，其中肿瘤发生浸润转移是其重要原因之一[3]。多发性骨髓瘤SET结构域蛋白(MMSET)是一种组蛋白甲基转移酶。MMSET主要在睾丸、胸腺及高度增殖的胚胎组织中表达，与人类胚胎发育等生理过程密切相关[4]。近年来研究表明，MMSET还与人类多种肿瘤的形成相关。研究者陆续在宫颈癌、头颈部癌等多种癌组织中发现MMSET过表达[5,6]，但国内外关于MMSET在卵巢癌中的研究仍较少。2017年9月～2018年2月，我们检测了HGSC癌组织中MMSET表达，并探讨其对卵巢癌细胞侵袭迁移的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 收集本院2016年12月～2017年5月手术患者的卵巢高级别浆液性腺癌组织45例份，入组患者年龄37～68(53.7±8.64)岁。病理类型均为高级别浆液性癌，有淋巴结转移者11例，无淋巴结转移者34例，FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期者16例，Ⅲ～Ⅳ期者29例，腹水量>500 mL者16例，≤500 mL者29例，肿瘤直径>10 cm者17例，≤10 cm者28例，CA125水平>300 U/mL者25例，≤300 U/mL者20例。正常卵巢组织27例份，因子宫内膜病变行全子宫双附件切除患者的正常卵巢组织，病理证实无卵巢病变，年龄40～70(52.09±5.11)岁。所有病患术前无放化疗、服用激素等治疗史，无其他干扰实验结果的病症。标本留取符合伦理。卵巢癌细胞系OVCAR3及CAOV3购自上海中科院。TRIzol、逆转录试剂、SBYR等购自大连Takara公司。PubMed网站设计并验证引物后由南京金斯瑞生物科技公司合成。一抗MMSET及GAPDH购自武汉Proteintech公司，山羊抗鼠二抗及山羊抗兔二抗购自北京中杉金桥公司。胰酶、1640培养基及胎牛血清购自美国HyClone公司；二甲基亚砜(DMSO)购自美国Solarbio公司；Lipo3000购自美国Invitrogen公司；细胞培养瓶、PBS、Transwell小室、Matrigel基质胶购于美国Corning公司；MMSET siRNA购自上海吉玛基因公司。

1.2 MMSET mRNA表达检测 采用RT-PCR法。按照Takara公司TRIzol试剂说明书提取RNA，根据RNA沉淀量大小加入适量DEPC水。检测提取的RNA样品浓度及纯度。取浓度及纯度达标的样品按相应步骤进行逆转录及扩增。相对定量法检测目的基因表达。MMSET正向引物：5′-TGTGTGAGCTGCCATGCTTCCA-3′,反向引物：5′-TGAGCATCCTGCTGCCAGACAA-3′；GAPDH正向引物：5′-GTCTCCTCTGACTTCCAACAGCG-3′,反向引物：5′-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3′。

1.3 MMSET蛋白表达检测 采用Western blotting法。剪取冻存的组织约20 mg，加入100 μL RIPA对组织进行裂解，静置30 min。待组织裂解充分后，14 000 g，4 ℃离心30 min，取上清蛋白原液。BCA法定蛋白，余样品与5×loading Buffer以4∶1的比例混匀并加热变性(100 ℃ 5 min)，配制5%浓缩胶及10%分离凝胶跑电泳，上样量30 μg。转完膜后将目的条带及内参条带膜置于5%脱脂奶粉中封闭2 h，后加入成比例稀释的一抗，4 ℃冷房摇床过夜。12 h后洗膜并加入二抗，室温下孵育2 h，ECL发光。采用Image J软件对条带的灰度值分析。

1.4 细胞培养与实验分组 人卵巢癌细胞系CAOV3及OVCAR3按RPMI1640+10%胎牛血清(FBS)+1%双抗(100 U/mL青霉素，100 U/mL链霉素)配制的培养基培养。培养环境37 ℃、5%CO2。实验分2组，si-NC组及si-MMSET组。si-NC组转染空白质粒，si-MMSET组转染靶基因质粒。

1.5 siRNA的合成、设计与转染 siRNA由上海吉玛基因公司合成，si-MMSET正向引物：5′-GCACUUCCAGGAUAUCAUUTT-3′,反向引物：5′-AAUGAUAUCCUGGAAGUGCTT-3′;si-NC正向引物：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′,反向引物：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。接种细胞于6孔板内贴壁生长至密度达到50%～70%进行转染，按说明书混合Lipo3000和siRNA,静置20 min后进行转染，转染6 h后将无血清培养基换为完全培养基。48 h后应用Western blotting法检测转染效果。

1.6 划痕面积测算 铺卵巢癌细胞CAOV3及OVCAR3于6孔板内，细胞融合至70%左右时进行转染,转染6 h后使用20 μL的灭菌枪头垂直于孔板平面进行划痕，洗去离壁的细胞，加入含2%血清的培养基培养。此时定为划痕0 h，分别于0、48 h于倒置显微镜下拍照记录划痕变化。并用Image J软件计算划痕面积，用48 h划痕面积除以0 h划痕面积，计算出划痕面积的变化率。

1.7 穿膜细胞数测算 进行Transwell实验。无血清培养基稀释Matrigel胶(8∶1)包被小室置于24孔板中，孵箱内过夜。细胞转染24 h后用胰酶消化并用无血清培养基制成细胞悬液，每个小室上加入约104个细胞，终体积200 μL，下室加入完全培养基500 μL，37 ℃孵育48 h。弃掉小室下室的培养基，95%乙醇固定细胞，约15 min，结晶紫细胞染色，约20 min。使用倒置显微镜于4个不同的视野拍照记录穿膜细胞数，取均值。

1.8 卵巢癌细胞CAOV3及OVCAR3中P-AKT、AKT蛋白表达检测 采用Western blotting法。接种卵巢癌细胞CAOV3及OVCAR3于6孔板内，贴壁生长至密度达到50%～70%进行转染，转染48 h后收集细胞，用Western blotting法检测siMMSET后卵巢癌细胞P-AKT、AKT蛋白表达。

2 结果

2.1 MMSET在HGSC癌及正常卵巢组织中表达比较 HGSC癌及正常卵巢组织中MMSET mRNA相对表达量分别为2.601 0±0.3145、1.121 0±0.097 7，二者比较，P<0.05。HGSC癌及正常卵巢组织中MMSET 蛋白相对表达量分别为0.942 5±0.076 6、0.616 6±0.063 7，二者比较P<0.05。

2.2 MMSET表达与HGSC患者临床病理特征的关系 HGSC患者有淋巴结转移者与无淋巴结转移患者卵巢组织中MMSET mRNA的相对表达量分别为5.107±2.068、2.262±0.264，二者比较，P<0.05；腹水量≤500 mL与>500 mL者卵巢组织中MMSET mRNA的相对表达量分别为2.290±0.293、4.676±1.457，二者比较，P<0.05；CA125≤300 U/mL与>300 U/mL患者卵巢组织中MMSET mRNA的相对表达量分别为1.756±0.268 1、3.244±0.480 8，二者比较，P<0.05；年龄≤55岁、>55岁卵巢组织中MMSET mRNA的相对表达量分别为2.421±0.468、3.760±1.021，二者比较，P>0.05；FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期患者MMSET mRNA的相对表达量分别为2.467±0.441、3.397±0.827，二者比较，P>0.05；肿瘤直径≤10 cm及>10 cm患者MMSET mRNA的相对表达量分别为2.836±0.423、3.392±1.272，二者比较，P>0.05。

2.3 转染后卵巢癌细胞中MMSET表达变化 si-NC组及si-MMSET组CAOV3卵巢癌细胞MMSET相对表达量分别为0.958 6±0.1472、0.445 4±0.051 6，OVCAR3卵巢癌细胞MMSET相对表达量分别为0.830 7±0.079 6、0.530 4±0.067 0，两组比较，P均<0.05。

2.4 MMSET基因沉默后卵巢癌细胞迁移能力比较 48 h后卵巢癌细胞CAOV3 si-NC组及si-MMSET组的划痕面积变化率分别为47.21%±5.38%、22.22%±6.20%，两组比较，P<0.05；卵巢癌细胞OVCAR3 si-NC组及si-MMSET组的划痕面积变化率分别为57.52%±2.76%、28.03%±2.48%，两组比较，P<0.05。

2.5 MMSET基因沉默后卵巢癌细胞侵袭能力比较 Transwell小室实验结果显示，卵巢癌细胞CAOV3 si-NC组及si-MMSET组的穿膜细胞数分别为(27±4)、(10±2)个，卵巢癌细胞OVCAR3 si-NC组及si-MMSET组的穿膜细胞数分别为(70±5)、(33±3)个，两组比较，P均<0.05。

2.6 MMSET基因沉默后卵巢癌细胞中P-AKT蛋白表达比较 si-NC组及si-MMSET组卵巢癌细胞CAOV3中P-AKT蛋白相对表达量分别为0.457 1±0.152 8、0.223 9±0.121 0，卵巢癌细胞OVCAR3中P-AKT蛋白相对表达量分别为0.6570±0.1068、0.439 9±0.100 2，两组比较，P均<0.05。

3 讨论

HGSC恶性度极高，患者5年存活率低于50%[7]。研究表明，表观遗传学的改变是影响肿瘤发生的重要因素之一。其中，组蛋白甲基转移酶是抗癌治疗的重要靶点，因其酶活性能得到有效控制。MMSET属于组蛋白甲基转移酶家族的一员，其SET结构域具有催化能力，能使得H3K36二甲基化。MMSET表达与人类胚胎发育过程密切相关，MMSET基因缺陷会导致以生长发育迟缓、先天性心脏缺陷为病理特征的Wolf-Hirschhorn综合征的发生[8]。MMSET的致癌作用最早见于多发性骨髓瘤，(4;14)(p16;q32)易位导致MMSET基因过表达[9]。

本研究结果显示，MMSET在HGSC癌组织中过表达且与腹水量、CA125水平及淋巴结转移相关。该结果与Yang等[10]研究结果基本一致。查阅近年来国内外相关文献表明，过表达的MMSET能促进前列腺癌、骨肉瘤等多种肿瘤的侵袭迁移进程[11]。然而，关于MMSET是否参与卵巢癌细胞的侵袭迁移进程目前尚不清楚。为探究MMSET对卵巢癌细胞侵袭迁移的影响，本研究通过Transwell小室实验及划痕实验分别测定了MMSET基因下调后卵巢癌细胞侵袭迁移能力的变化。结果表明，MMSET下调后细胞的侵袭迁移能力显著降低。可见MMSET在卵巢癌细胞的侵袭迁移中起到重要作用，然而关于MMSET调控卵巢癌细胞侵袭迁移的具体机制目前尚未深入研究。Lu等[11]在骨肉瘤中同样发现上调的MMSET基因能促进骨肉瘤细胞的侵袭迁移进程，且该过程可能是通过抑制E-cadherin表达实现。异常表达的miRNAs在癌症细胞的起始、进展和转移过程起重要作用。

AKT信号通路作为原癌基因通路在包括卵巢癌在内的多种恶性肿瘤中处于激活状态，且过度激活的AKT信号通路与卵巢癌的增殖、侵袭转移、细胞周期进程、血管形成及耐药等恶性行为密切相关[12]。本研究发现基因沉默卵巢癌细胞中MMSET表达后，P-AKT蛋白表达随之减少，表明MMSET可能是通过磷酸化激活AKT信号通路参与卵巢癌的发展进程，该结果与Li等[13]研究结果相符。此外，Li等[13]研究还表明MMSET与PI3K/AKT通路间存在相互调控的环路关系。然而在卵巢癌中是否存在该调控环路尚需进一步实验验证。

综上所述，MMSET在HGSC中过表达，过表达的MMSET与卵巢癌患者的腹水量、CA125水平、淋巴结转移等临床病理特征及卵巢癌细胞的侵袭迁移能力相关，且MMSET可能通过调控AKT信号通路来参与卵巢癌的恶性进程。