血浆内皮微粒水平与颅内动脉狭窄的关系

潘勇，黎红华,2

(1南方医科大学附属武汉临床学院，武汉 430070；2中国人民解放军武汉总医院)

颅内动脉粥样硬化是缺血性卒中的主要原因，有数据显示，近50%的缺血性卒中由颅内动脉粥样硬化狭窄引起，且颅内动脉狭窄越严重、病变范围越广泛，卒中的复发率越高，预后越差[1]。因此，研究颅内动脉粥样硬化的危险因素及其预测指标对缺血性卒中的防治有重要意义。血管内皮功能损伤与动脉粥样硬化的发生发展密不可分。内皮微粒(EMP)是内皮细胞激活或凋亡时释放的微粒，其水平与血管内皮功能损伤密切相关，目前已受到越来越多学者的关注。近年来动物实验研究表明，内皮微粒还可通过增加黏附分子(ICAM、VCAM)分泌、减少NO分泌等多种途径，促进动脉粥样硬化的形成与发展[2]。既往有学者研究发现，内皮微粒与冠状动脉粥样硬化严重程度有关[3]，但内皮微粒与颅内动脉粥样硬化关系的研究尚少。因此，本研究旨在探讨EMP和颅内动脉粥样硬化狭窄间的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2016年6月～2017年2月于中国人民解放军武汉总医院神经内科住院并接受头颅CTA检查的受试者172例。按是否存在颅内动脉狭窄分为颅内动脉狭窄组121例(颅内动脉病变支数≥1)和无颅内动脉狭窄组(对照组)51例。患者均符合以下标准。入选标准：①年龄40～85岁；②至少有1个以上的下列动脉粥样硬化危险因素：高血压、糖尿病、高脂血症、吸烟；③有完善的脑血管影像学检查和颈部超声检查。排除标准：①为排除急性脑梗死、脑出血等急性事件对EMP水平的影响，排除急性脑卒中患者；②为排除混杂因素的影响，排除合并存在明显的颅外动脉狭窄者(颈部血管狭窄大于50%)；③有症状的外周动脉疾病；④炎性疾病、动脉瘤、心房纤颤、肝脏或肾脏疾病、心血管介入手术史、脑部手术史等。颅内动脉狭窄组男82例、女39例，年龄(62.8±10.1)岁。高血压93例，糖尿病50例，高脂血症43例，吸烟史60例，既往卒中史22例，冠心病14例，收缩压(158.2±20.5)mmHg，舒张压(92.9±14.0)mmHg，HbA1c为6.4%±1.5%，FPG(6.6±2.6)mmol/L，TC(4.8±1.4)mmol/L，TG(1.8±1.3)mmol/L，HDL-C(1.1±0.3)mmol/L，LDL-C(2.4±0.9)mmol/L，Hcy(16.5±11.2)μmol/L，纤维蛋白原(3.6±0.7)g/L，颈动脉中膜厚度(1.1±0.2)mm。对照组男31例、女20例，年龄(60.3±9.1)岁。高血压34例，糖尿病13例，高脂血症17例，吸烟史22例，既往卒中史4例，冠心病5例，收缩压(152.5±21.3)mmHg，舒张压(91.8±14.2)mmHg，HbA1c为6.3%±1.2%，FPG(5.7±1.6)mmol/L，TC(4.6±0.9)mmol/L，TG(1.7±1.0)mmol/L，HDL-C(1.2±0.3)mmol/L，LDL-C(2.3±0.6)mmol/L，Hcy(14.3±7.8)μmol/L，纤维蛋白原(3.3±0.6)g/L，颈动脉中膜厚度(1.0±0.2)mm。颅内动脉狭窄组的糖尿病患病率、FPG、纤维蛋白原、颈动脉中膜厚度高于对照组，差异有统计学意义(P均<0.05)。两组间年龄、性别、高血压、高血脂、吸烟史、冠心病史、既往卒中史及其他生化指标未见统计学差异(P均>0.05)。

1.2 血浆EMP检测 172例观察对象于入院第2天清晨空腹抽取肘静脉血3 mL于枸橼酸钠抗凝的试管中，1 200 r/min离心10 min，抽取上清液，15 000 r/min离心30 min，经2次离心后的上清液即为血小板贫瘠的血浆。应用美国BD 公司提供的CD31、CD42两种荧光素标记的特异性抗体标记样本，100 μL血浆样品加入CD31、CD42b抗体各5 μL后，于室温下孵育20 min，加入3.8 μm标准计数微球、0.8 μm校准微球后，添加PBS缓冲液至500 μL。以美国BD公司FACSCalibur 型流式细胞仪检测血浆EMP水平，上样量为106events。EMP定义为大小在0.8 μm及以下的CD31+/CD42b-微粒。

1.3 动脉狭窄的诊断及颅内动脉粥样硬化狭窄的负荷评估 以头颈部CTA为检测手段，按WASID标准和NASCET标准，将血管管腔直径减少>50%或闭塞定义为颅内或颅外动脉粥样硬化性狭窄。颅内动脉粥样硬化狭窄的负荷评估包括颅内动脉狭窄病变的数量及狭窄程度。颅内动脉狭窄数量为狭窄率≥50%的动脉段数量。狭窄程度评分参照Samuels标准[4]，狭窄程度在50%～69%计1分，70%～99%计2分，闭塞计3分。若一个动脉段有多处狭窄，按狭窄最重处计算。

2 结果

2.1 两组血浆EMP水平比较 颅内动脉狭窄组、对照组EMP水平分别为(224.0±61.5)、(112.3±40.5)个/μL，两组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。在校正混杂因素如年龄、性别、高血压、糖尿病、高血脂、吸烟、收缩压、FPG、纤维蛋白原、颈动脉中膜厚度后，二元Logistic回归分析显示，EMP水平是颅内动脉狭窄的独立预测因子(OR=1.047，P<0.01)。

2.2 EMP水平与颅内动脉粥样硬化负荷间的相关性 按颅内动脉段病变支数分为无明显狭窄组(血管病变支数小于1支)51例，局限狭窄组(血管病变支数1～2支)61例，广泛狭窄组(血管病变支数大于2支)60例。等级Logistic回归分析显示，在控制可能的混杂因素(年龄、性别、高血压、糖尿病、高血脂、吸烟、收缩压、FPG、纤维蛋白原、颈动脉中膜厚度)后，EMP(OR=1.037，95%可信区间1.099～3.414)和纤维蛋白原(OR=1.937，95%可信区间1.028～1.046)与颅内动脉狭窄病变范围呈独立正相关。按颅内动脉狭窄严重程度评分，分为低分组(1分以下)51例、中分组(1～3分)67例、高分组(3分以上)54例。等级Logistic回归显示，在控制上述混杂因素以后，EMP(OR=1.030，95%可信区间1.023～1.038)和年龄(OR=1.046，95%可信区间1.006～1.087)与颅内动脉狭窄严重程度呈独立正相关。Spearman相关分析显示，EMP与颅内动脉粥样硬化负荷呈正相关(血管段数量：r=0.776,P<0.01；动脉狭窄度评分：r=0.766,P<0.01)。校正可能的混杂因素后，偏相关分析显示二者之间仍存在相关性(病变血管段数量：r=0.635,P<0.01；动脉狭窄度评分：r=0.663,P<0.01)。

3 讨论

EMP是激活或凋亡的内皮细胞释放出来的微小囊泡，携带有母体细胞的mRNA、miRNA、受体、特殊蛋白等物质。在内皮功能受损时，EMP释放明显增加，目前，EMP作为反映内皮损伤的指标已被国内外学者认可[5]。近年来研究发现，EMP具有促进动脉粥样硬化的作用。Jansen等将高糖环境下培养出的EMP，注射至ApoE-/-小鼠血管内。结果与空白对照组小鼠相比，实验组小鼠的动脉粥样硬化更明显，表现为斑块增大，内皮舒张功能下降。进一步研究发现，EMP可通过以下途径促进动脉粥样硬化的形成与发展：①高糖环境下诱导的EMP可促进P38MAPK-ICAM/VCAM信号通路的表达，促进内皮炎症、损害内皮功能，从而促进动脉粥样硬化的发生。②EMP通过PI3K/AKT-eNOS-NO通路损害血管内皮舒张功能。③EMP通过miR126-SPRED1-MAPK途径，导致内皮细胞的迁移和增殖减少，黏附因子和趋化因子增多，从而加快动脉粥样硬化的发展[6～8]。EMP不仅是颅内动脉狭窄的预测指标，其同时亦可能成为动脉粥样硬化的一个治疗靶点。Diamant等[9]研究表明，他汀类药物、ACEI类药物可减少血浆EMP的释放，但目前关于此类药物的研究还不够深入。EMP能否成为动脉粥样硬化一个新的治疗靶点，尚有待进一步研究。

研究中我们发现，颅内动脉狭窄组的糖尿病患病率、FPG、颈动脉中膜厚度、纤维蛋白原水平均高于对照组。糖尿病是动脉粥样硬化传统危险因素，有学者研究发现糖尿病病程、FPG与大血管病变关系更为密切，而HbA1c与小血管病变关系更密切[10，11]。这或许可以解释本研究中颅内动脉狭窄组FPG较对照组升高，而HbA1c无统计学差异。颈动脉中膜厚度作为反映全身动脉粥样硬化情况的窗口，已成为心脑血管狭窄的预测指标。本研究中纤维蛋白原不仅与颅内动脉狭窄相关，在控制混杂因素后，还与颅内动脉狭窄范围独立正相关。既往有少许研究显示纤维蛋白原与冠状动脉狭窄严重程度独立相关[12]。但纤维蛋白原作为一种急性时相蛋白受诸多因素的影响，因此，二者的关系尚需进一步研究证实。本研究结果显示，在校正了年龄、性别、高血压、糖尿病、高血脂、吸烟、收缩压、FPG、纤维蛋白原、颈动脉中膜厚度后，血浆EMP水平和颅内动脉狭窄相关。进一步分析发现，在控制混杂因素后，EMP水平与颅内动脉病变的广泛程度和狭窄严重程度呈独立正相关。表明EMP是独立的预测颅内动脉狭窄及其严重程度的指标之一。目前国内外研究显示，EMP与动脉粥样硬化相关疾病有关。既往学者报道，EMP与冠状动脉狭窄、冠心病、外周血管疾病的发生有关[3，13，14]。但目前EMP与颅内动脉狭窄的关系尚未见研究。本研究中，EMP水平和颅内动脉粥样硬化负荷间呈正相关的可能原因：糖尿病、高血压、高血脂等心脑血管病危险因素会引起EMP的升高[10]，因此，EMP水平与颅内动脉粥样硬化的相关性可能只是各种传统危险因素的综合体现。但这种相关性在应用Logistic回归控制了混杂因素后仍然存在。因此，EMP本身对动脉粥样硬化发生发展的作用不容忽视。

综上所述，CD31+/CD42b-内皮微粒可作为颅内动脉粥样硬化性狭窄严重程度的预测指标，临床通过检测CD31+/CD42b-内皮微粒，可筛选颅内动脉狭窄高危患者，对缺血性卒中的防治有重要意义。