核酸适配体筛选方法研究进展*

韩小东，符兆英，郭姝彤，张正祥

延安大学医学院(延安 716000)

·综述·

核酸适配体筛选方法研究进展*

韩小东，符兆英，郭姝彤，张正祥△

延安大学医学院(延安 716000)

*国家自然科学基金资助项目(81760732)

陕西省科学技术研究发展计划项目(2016SF-280)

△通讯作者

指数富集的配基数系统进化(SELEX)技术的基本过程是用化学方法合成一个单链寡核苷酸库，将之于与靶标物质混合，寡核苷酸链与靶标物质结合形成复合物，去除未结合的核酸链后，再将结合的核酸分子与靶标物质分离，以此寡核苷酸分子为模板进行PCR扩增，用其产物进行下一个循环的筛选。经过数次循环，即可得到能与靶标物质高亲和力高特异性结合的核酸适配体分子。本文综述了SELEX技术筛选核酸适配体技术的一些研究进展。

自从上世纪90年代L. Gold 和J.W. Szostak创立了用指数富集的配基系统进化(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)技术或体外筛选(In vitro selection)技术制备寡核苷酸适配体(Aptamer)以来，适配体或核酸适配体的研究与应用已经成了医学、药学、生物学、化学等多学科广泛交叉关注的一个领域[1-3]。核酸适配体领域的快速发展，离不开适配体筛选方法的不断进步。在传统技术的基础上，近年来已经改良、优化或发展出了多种不同的SELEX筛选技术和自动化SELEX技术。本文对核酸适配体筛选方法的进展作一综述。

1 SELEX基本技术SELEX技术首先是构建一个随机的寡核苷酸库，寡核苷酸链的长度为20～40 nt，库容量为 1014～1015条寡核苷酸链；其所包含的各种不同种立体构象，几乎可以与自然界存在的所有种类的靶分子结合。将随机寡核苷酸库与靶分子混合，在一定条件下进行一段时间反应，寡核苷酸链即可与相应的靶分子结合形成复合物，根据二者之间亲和力的不同结合的牢固程度不同。将未结合的和结合不牢固的寡核苷酸链洗脱掉，并将寡核苷酸链与靶分子分离，把初步筛选富集起来的寡核苷酸链用PCR进行扩增并分离纯化后，进行下一轮的筛选。如此反复，经过数轮或十多轮的筛选，即可把与靶分子结合亲和力最高的寡核苷酸分子筛选出来。所得到的寡核苷酸文库要进行测序和克隆，有时需要进行特异性修饰，最后得到的能与靶分子高特异性高亲和力结合的寡核苷酸链即是所要筛选的适配体[4-6]。由于SELEX技术所用的PCR聚合酶的保真度低，每一次的合成产物都会有一些变异体，所以寡核苷酸库的容量在筛选过程中实际上得到了增加。以上得到的是DNA适配体，如果是制备RNA适配体，则需要把起始的DNA寡核苷酸库转录为RNA寡核苷酸库，再进行筛选。在筛选过程中，需要用RT-PCR法，将每次筛选得的RNA链逆转录成DNA并扩增，然后将扩增所得的DNA再转录为RNA，再进行下一轮的结合与筛选[7-8]。

2细胞SELEX技术细胞SELEX技术(Cell-SELEX)是用整个细胞(包括细菌、真菌和动物细胞)与寡核苷酸库作用，筛选出的适配体能与细胞表面分子结合[9]。用Cell-SELEX筛选到的适配体除了可以用于诊断及实验研究外，特别是可以用于药物导向输送，比如用肿瘤细胞筛选出的适配体与细胞毒性药物等偶联结合后就可以把药物导向于肿瘤细胞可用于治疗肿瘤。Cell-SELEX技术的优点是省去了靶分子(蛋白)的纯化步骤，并保留了细胞表面靶分子的自然构象。但是，因为细胞表面含有许许多多的能与寡核苷酸链结合的靶分子，所以需要用一定的方法去除能与非特异的细胞表面分子结合的寡核苷酸链，以获得所需要的只与自己所需的靶分子结合的适配体。目前的Cell-SELEX技术用不表达或低表达自己所需靶分子的细胞进行反筛选或消减筛选，一般是用这些细胞从筛选得到的次级文库中去除非特异的寡核苷酸链[10-12]。

3毛细管电泳SELEX技术将靶标分子与寡核苷酸链结合形成的复合物与未结合的寡核苷酸链进行分离是SELEX技术的关键步骤之一。靶标分子与核酸链在自由溶液中的相互作用能够模拟体内环境，也有利于保持二者的天然结构，因此在自由溶液中实现靶标分子与寡核苷酸库的结合和分离是一种理想的方法。用毛细管电泳SELEX法可以使靶标分子与寡核苷酸链在自由溶液中相互结合并可使迁移速率有明显差异的靶标分子与寡核苷酸链结合形成的复合物和游离的寡核苷酸链实现分离(复合物的迁移率比游离核酸分子的迁移率慢)，在毛细管出口端可以定时收集靶标分子-寡核苷酸链复合物[13]。用毛细管电泳SELEX，只需2～4 轮循环即可筛选出能结合大分子靶标分子如蛋白质的适配体。毛细管电泳SELEX技术极大地缩短了SELEX筛选过程、提高了SELEX的筛选效率，用这种技术，已经筛选得到了能结合多种靶标物质的适配体[14-15]。但由于毛细管电泳仪价格昂贵、实验成本高，所以限制了其大面积使用。

4磁珠SELEX技术SELEX的筛选方法主要可以分为电泳分离和固相偶联两大类。毛细管电泳技术属于电泳分离法；固相偶联法主要有磁珠法、硝酸纤维素膜法、亲和柱层析法和微流芯片法等，它们的基本原理是将靶标分子共价或非共价结合于一个固相载体，液相中的寡核苷酸分子通过自由扩散，遇到固相载体表面的相对应的靶标分子即可与其结合，除去未结合或结合弱的寡核苷酸分子，将结合在靶标分子上的寡核苷酸链洗脱/分离后进行PCR扩增和下一轮循环[16]。磁珠法是比较新和比较常用的一种SELEX筛选方法，该方法的优势在于具有球形的展示面便于靶标物质的充分展示，利用磁性进行分离操作简便快速，能节省靶分子的用量，此外磁珠分离可用于自动化的筛选。磁珠载体的表面修饰形式种类较多，如链霉亲和素包被磁珠、氨基修饰磁珠、羧基修饰磁珠、环氧基活化磁珠和甲苯磺酰基修饰磁珠等[17]。用磁珠SELEX法进行筛选，一般需经10轮上下的循环可得到相应的适配体。

5自动化SELEX技术Cox等人于2001年首次建立了自动化的SELEX筛选技术，并筛选得到了溶菌酶的适配体，他们用的自动化工作台包括机械性操控、PCR热循环、磁珠分离、酶冷却、多屏真空过滤、自动移液等装置。其SELEX筛选流程都是通过预设好的程序自动化进行，包括：①用链霉亲和素-生物素系统将生物素化的靶蛋白固定于磁珠，②寡核苷酸链与靶蛋白分子的特异性结合，③靶蛋白与寡核苷酸链的分离，4RT-PCR 扩增和转录。最后筛选得到适配体分子被克隆到载体中进行测序和特性鉴定。用这种自动化筛选技术，在2 d内就能完成12轮的筛选[18]。该自动化工作台的不足之处是需要用纯化的蛋白质作为靶标，因而限制了其应用。鉴此，他们后来对自动化工作台做了改进：在体外转录翻译合成靶蛋白时，向基因的 5′末端引入T7启动子和生物素蛋白连接酶的识别序列(标签)，向基因的 3′末端引入生物素蛋白连接酶基因及T7终止子，转录后得到两个顺式mRNA，翻译后得到的目的蛋白含有生物素蛋白连接酶和一个生物素蛋白连接酶识别序列标签。当加入游离的生物素时，生物素蛋白连接酶和生物素蛋白连接酶识别标签，将生物素共价结合到目的蛋白上，便于将靶蛋白固定在链霉亲和素包被的磁珠上[19]。2005年，Stoltenburg等在以上改进的固定靶分子于磁珠原理的基础上，增加了荧光标记法，用于DNA定量，进一步发展了自动化SELEX技术，能够快速地筛选不同特性和不同大小的靶标分子[20]。

6微流控SELEX技术微流控SELEX技术是将微流控微阵列技术与SELEX结合的一种适配体筛选方法，具有高效、快速的特点，分为基于溶胶-凝胶的微流控SELEX和基于磁珠筛选的微流控SELEX。基于溶胶凝胶的微流控SELEX将靶标物质包被于由硅酸盐玻璃制成的溶胶凝胶中，该溶胶凝胶具有纳米多孔结构，寡核苷酸分子通过纳米多孔结构扩散并与靶标物质结合。有研究人员用基于溶胶凝胶的微流控SELEX，经7个循环的筛选即得到了可结合小分子靶标黄嘌呤的核酸适配体。基于磁珠的微流控SELEX将靶标物质固定于磁珠微球，接下来用微流体微阵列，比如MMS微阵列进行筛选富集。MMS微阵列系统应用了能够被外部磁体磁化的铁磁材料制作的微通道，使分离效率得到了提高，解决了此前的微阵列有可能出现的微阵列通道内部微气泡导致的流体扭曲问题和磁珠在微通道内的堆集问题。MMS微阵列经改良增加了正筛选和负筛选单元后，经7个循环的筛选，得到了可结合肌红蛋白的核酸适配体。将MMS微阵列系统进行改良，增加竞争性微阵列以检测寡核苷酸和靶标物质结合的特异性和亲和力，筛选获得了可结合胎儿甲种蛋白的核酸适配体。将SELEX筛选程序中寡核苷酸与靶标物质的结合、分离和DNA扩增整合于一个微阵列，能明显提高筛选效率，每次筛选循环仅需1 h左右的时间[21-23]。

7高通量SELEX技术传统的SELEX筛选，有可能使一些具有高亲和力的寡核苷酸序列被丢失。由于每次循环是依赖于PCR扩增次级文库，因PCR存在的偏好性或优势扩增特性，会使初始文库中亲和力很高但频次低的寡核苷酸序列随筛选而丢失，所以最后得到的序列不一定就是具有最高亲和能力的序列。利用高通量测序技术对每一轮的筛选结果进行高通量的序列测定与分析，能够实现对筛选富集过程的全程监测，这不仅仅可以及时地调整筛选压力以提高筛选的效率和减少筛选的盲目性，同时还可以更进一步地解析核酸适配体的结构与功能之间的关系[23-24]。有研究人员利用微流控SELEX筛选血小板衍生生长因子的适配体，在筛选时引入了高通量测序技术，经3轮筛选即得到了解离常数小于3 nMol的核酸适配体。与传统 SELEX相比，所得适配体的亲和力提高了3～8倍、特异性提高了2～4倍。还有研究人员结合表面等离子共振和微流体芯片做X盒结合蛋白1(XBP-1)适配体的高通量筛选，用表面等离子共振装置对每一轮筛选的结果进行亲和力测定，经过4 轮筛选后，观测到了表面等离子信号的明显改变，经6轮筛选后得到了解离常数为8 nMol的靶向XBP-1的核酸适配体[25]。

8高保真SELEX技术高保真SELEX技术于2015年首次建立，该技术具有以下特点：1传统的SELEX技术有一缺陷是两端的固定序列会对寡核苷酸链的空间折叠产生影响而降低起始文库的多样性，高保真SELEX技术在起始文库中使用了一种封闭元件(与寡核苷酸链两端的固定序列互补的序列)，从而增加了起始文库的多样性。2高保真SELEX技术将靶标物质固定在涂有吸附钝化的聚乙二醇和表面活性剂的微量滴定板上，这一操作不仅能显著地减少非特异性结合、增加靶标物质与寡核苷酸链结合的特异性，还可以在寡核苷酸链和邻近靶标物质之间起一个桥接作用。3DNA扩增时使用数字聚合酶链反应，从而使扩增更具特异性并能实现绝对定量。有研究人员用这种新的高保真SELEX技术，筛选了凝血酶α、人凝血因子IXa、人因子凝血X和补体D因子的核酸适配体，经过3轮筛选后，就得到了与靶分子结合的亲和力(解离常数)达到纳摩尔级水平的核酸适配体[26]。

9小结SELEX技术自从建立至今已经历经20多年的发展历程，期间筛选方式出现了多样化，筛选结果得到了快速化，并出现了自动化的筛选。SELEX的靶标物质也从金属离子、有机小分子、小分子药物、核酸和蛋白质等，拓展到了细胞和组织等复杂靶标。但目前尚未建立可针对任意靶标的SELEX技术，也没有建立起一个标准化的筛选流程，此外，SELEX 筛选也不能保证必能得到所想得到的适配体。SELEX筛选的成功受众多因素的制约，如寡核苷酸文库的设计、筛选技术的选择尤其是分离技术的针对性、靶分子的结构与性质、筛选缓冲液及其离子种类等均影响筛选效果。发展筛选效率更高和针对的靶标更为普遍的筛选手段是SELEX技术今后需要致力研究的方向。

[1] Zhuo Z, Yu Y, Wang M,etal. Recent advances in SELEX technology and aptamer applications in biomedicine[J]. Int J Mol Sci, 2017, 18(10): E2142.

[2] Jijakli K, Khraiwesh B, Fu W,etal. The in vitro selection world[J]． Methods, 2016, 106:3-13.

[3] 田红英，符兆英. SELEX技术的原理和核酸适配体在医学上的应用进展[J]．细胞与分子免疫学杂志，2012, 28(10):1103-1106.

[4] Gopinath SC. Methods developed for SELEX[J]． Anal Bioanal Chem, 2007, 387(1):171-182.

[5] Yüce M, Ullah N, Budak H. Trends in aptamer selection methods and applications[J]． Analyst,2015, 140(16):5379-5399.

[6] Blind M, Blank M. Aptamer selection technology and recent advances[J]． Mol Ther Nucleic Acids,2015, 4:e223.

[7] Tan SY, Acquah C, Sidhu A,etal. SELEX Modifications and bioanalytical techniques for aptamer-target binding characterization[J]． Crit Rev Anal Chem,2016, 46(6):521-537.

[8] Hamada M. In silico approaches to RNA aptamer design[J]． Biochimie. 2017,S0300-9084(17)30257-30252.

[9] Catuogno S, Esposito CL. Aptamer cell-based selection: overview and advances[J]． Biomedicines，2017, 5(3)： E49.

[10] Chen M, Yu Y, Jiang F, et al. Development of cell-selex technology and its application in cancer diagnosis and therapy[J]． Int J Mol Sci,2016, 17(12): E2079.

[11] Lyu Y, Chen G, Shangguan D,etal. Generating cell targeting aptamers for nanotheranostics using cell-SELEX[J]． Theranostics,2016, 6(9):1440-1452.

[12] Jin C, Zheng J, Li C,etal. Aptamers selected by cell-SELEX for molecular imaging[J]． J Mol Evol, 2015, 81(5-6):162-71.

[13] Lou B, Chen E, Zhao X,etal. The application of capillary electrophoresis for assisting whole-cell aptamers selection by characterizing complete ssDNA distribution[J]．J Chromatogr A, 2016, 1437:203-209.

[14] Hamedani NS, Müller J. Capillary Electrophoresis for the selection of DNA aptamers recognizing activated protein C[J]．Methods Mol Biol,2016, 1380:61-75.

[15] Luo Z, Zhou H, Jiang H,etal. Development of a fraction collection approach in capillary electrophoresis SELEX for aptamer selection[J]． Analyst, 2015, 140(8):2664-2670.

[16] Duan N, Gong W, Wu S,etal. An ssDNA library immobilized SELEX technique for selection of an aptamer against ractopamine[J]． Anal Chim Acta,2017, 961:100-105.

[17] Darmostuk M, Rimpelova S, Gbelcova H,etal. Current approaches in SELEX: An update to aptamer selection technology[J]． Biotechnol Adv, 2015, 33(6PT2):1141-1161.

[18] Eulberg D, Buchner K, Maasch C,etal. Development of an automated in vitro selection protocol to obtain RNA-based aptamers: identification of a biostable substance P antagonist[J]．Nucleic Acids Res,2005, 33(4):e45.

[19] Hünniger T, Wessels H, Fischer C,etal. Just in time-selection: A rapid semiautomated SELEX of DNA aptamers using magnetic separation and BEAMing[J]． Anal Chem,2014, 86(21):10940-10947.

[20] Huge BJ, Flaherty RJ, Dada OO,etal. Capillary electrophoresis coupled with automated fraction collection[J]． Talanta,2014, 130:288-293.

[21] Dembowski SK, Bowser MT. Microfluidic methods for aptamer selection and characterization[J]． Analyst, 2017, 143(1):21-32.

[22] Soundy J, Day D. Selection of DNA aptamers specific for live Pseudomonas aeruginosa[J]． PLoS One, 2017, 12(9):e0185385.

[23] Pei S, Slinger BL, Meyer MM. Recognizing RNA structural motifs in HT-SELEX data for ribosomal protein S15[J]． BMC Bioinformatics, 2017, 18(1):298.

[24] Scoville DJ, Uhm TK, Shallcross JA,etal. Selection of DNA aptamers for ovarian cancer biomarker CA125using one-pot SELEX and high-throughput sequencing[J]． J Nucleic Acids,2017, 2017:9879135.

[25] Lou TF, Weidmann CA, Killingsworth J,etal. Integrated analysis of RNA-binding protein complexes using in vitro selection and high-throughput sequencing and sequence specificity landscapes[J]． Methods,2017, 118:171-181.

[26] Huang BT, Lai WY, Chang YC,etal. A CTLA-4 antagonizing DNA aptamer with antitumor effect[J]． Mol Ther Nucleic Acids, 2017, 8:520-528.

(收稿：2017-11-20)

@指数富集的配基数系统进化 @核酸适配体 寡核苷酸类 筛选

R392.1

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2018.03.043